分析為何細胞狀態(tài)差

細胞狀態(tài)很差，常常出現(xiàn)的現(xiàn)象是：細胞邊緣不清晰、細胞不飽滿、折光性差、背景比較臟、黑點很多、細胞碎片多（細胞凋亡后的細胞碎片）、單個細胞內(nèi)有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細胞出現(xiàn)老化，也就是細胞比較扁平、增殖減緩、細胞核體積增大、細胞突觸變多，此時觀察到的細胞狀態(tài)也是不正常的。

▲ 圖1：背景很臟；

▲圖2：有較多小黑點

因此細胞狀態(tài)差只是對這些現(xiàn)象的一種籠統(tǒng)說法。

究其根本，細胞狀態(tài)變差主要是由于兩種原因：

1 細胞營養(yǎng)條件不夠

2 細胞被污染了

今天我們將深入分析影響細胞狀態(tài)的這些原因。

一、營養(yǎng)條件不夠

細胞營養(yǎng)條件不夠時，就需要從培養(yǎng)基方面考慮。

（1）血清

由于血清來源于動物，且含有細胞培養(yǎng)中所需的各種營養(yǎng)（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等），這奠定了血清是細胞培養(yǎng)實驗中最基礎(chǔ)普遍的試劑的基礎(chǔ)。

市面上的牛血清產(chǎn)品名稱雖然五花八門，但根據(jù)其不同的特性，追其根本，大致可分為以下四種。根據(jù)牛的取血年齡可以區(qū)分：

胎牛血清（Foetal Bovine Serum，簡稱FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心臟穿刺采血得來的血清。

國產(chǎn)胎牛血清（并無明確定義，但通常用此命名）指的是出生4-6小時，且未進行哺乳（unsuckled）進食的新生牛，有時還稱作國產(chǎn)新生牛血清。 

新生牛血清（Newborn Calf Serum，簡稱NBCS，或稱小牛血清）指的是出生14天-3個月進行取血的牛血清。

成年牛血清（Adult Bovine Serum，簡稱ABS）指的是取血時牛齡通常超過12個月的牛血清。

以上取血牛齡的差異主要是受當?shù)貒倚竽翗I(yè)的發(fā)展及法規(guī)限制影響，因為牛血多為畜牧業(yè)副產(chǎn)業(yè)，并未有專門為取血而養(yǎng)的牛。

這幾種不同牛齡血清所含的促細胞生長因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組分與比例不同。常規(guī)來說，牛齡越小的牛血清，細胞培養(yǎng)效果越好。但是也需要根據(jù)自己培養(yǎng)的細胞類型來選擇最合適的血清。

同一血清不同批號內(nèi)的成分和營養(yǎng)組成比例會不同，因為血清來源于動物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。每個批號的組分和百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。因此在實驗過程中，需要經(jīng)過測試來找尋合適的血清批次。當實驗需要更換血清時，細胞需要有一段適應(yīng)期。因此，要根據(jù)自己的細胞種類進行合適的選擇。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基

培養(yǎng)細胞時，除了血清還需要添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混合成為*培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是成分確定且知其確切含量的，可以補充血清中缺乏的營養(yǎng)元素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般含有氨基酸、無機鹽、維生素、含碳物質(zhì)，蛋白和其他營養(yǎng)元素，每種成分對于細胞存活、代謝等功能都有不同影響，不同細胞系需要的成分含量也不同，因此市面上會存在各類培養(yǎng)基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基礎(chǔ)培養(yǎng)基也需要根據(jù)自己培養(yǎng)的細胞種類進行更合適的選擇。自行配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，需要注意是否需另外添加營養(yǎng)物或必需物至培養(yǎng)基中（如：碳酸氫鈉）并調(diào)整pH值。使用不適合的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，細胞仍可生長但特性會改變。培養(yǎng)基中常用的酚紅（pH指示劑）本身有微弱雌激素作用，會刺激具有雌激素受器的細胞生長。

如果您都是按照操規(guī)范保存培養(yǎng)基和培養(yǎng)細胞，那么我們繼續(xù)考慮污染情況。

二、細胞被污染

污染情況通常從以下幾部分考慮。

通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、細菌、支原體、黑膠蟲、病毒、細胞交叉污染等。

這些污染都是有其自有特征的噢~

（1）真菌污染

這類微生物外觀類似棉絮狀的漂浮物，在顯微鏡下可觀察到菌絲體，污染早期不會使培養(yǎng)基變黃。

（2）酵母菌污染

顯微鏡下常見成串的珠狀物形態(tài)呈卵形，大約比細胞小5~10倍，當其進行出芽生殖時，會聚集成連體結(jié)構(gòu)；爆發(fā)污染嚴重時，會造成培養(yǎng)基pH值改變，不易除去。

（3）細菌污染

培養(yǎng)基在短時間內(nèi)變成黃色或白色渾濁，細胞停止生長甚至死亡；有些狀況下培養(yǎng)基顏色改變不明顯但細胞形態(tài)會變異（出現(xiàn)多角，多核狀況）、細胞不附著，顯微鏡觀察背景有大量黑點。

（4）支原體污染

支原體種類較多，常以寄生或腐生營養(yǎng)方式生長，廣泛存在于環(huán)境之中，是細胞培養(yǎng)過程常見污染，經(jīng)常來源于實驗人員（支原體常見于人體皮膚、呼吸道、生殖道和消化道）、動物源血清及胰酶、消毒不*的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通過一般標準的細胞培養(yǎng)過濾方法，0.22μm過濾膜。支原體增長速度相較于細菌比較緩慢，污染初期（輕微）培養(yǎng)基可能依然清澈不會變黃，所以輕微污染時不容易用常規(guī)方法發(fā)現(xiàn)（細胞外觀觀察或是DNA染色法）確認。

▲ 左圖：感染前；                                                ▲ 右圖：感染后

支原體污染不但會緩慢改變細胞形態(tài)、增殖、基因表達、蛋白合成及代謝反應(yīng)，它攜帶的DNA/RNA與蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌體實驗結(jié)果偏差。

（5）黑膠蟲污染

目前科學(xué)界對黑膠蟲并無定論，認為是不明沉淀現(xiàn)象或多種未知生物污染現(xiàn)象的通稱。在高倍率顯微鏡頭下，可觀察到各式形狀的小黑點（卵圓狀、球狀、桿狀等）、活躍的布朗運動及明顯游動現(xiàn)象，部分黑膠蟲具有細胞毒性，可引起細胞生長遲緩或裂解凋亡。

▲ 黑膠蟲污染

（6）病毒污染

病毒感染可能來自宿主動物細胞或病人，病毒感染及傳播具有細胞專一性，在細胞培養(yǎng)污染物中是相對較難檢測的。然而一旦細胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態(tài)變形，嚴重時會在單層細胞上觀察到局部破損空斑。

▲ 左圖：Before infection；右圖：After 24 hours infectiond

（7）細胞交叉污染

曾有文獻報道統(tǒng)計，目前使用的細胞株大約有15~20%不是科學(xué)家們所認為的細胞，而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，細胞來源和細胞株身份鑒定檢測觀念普遍缺乏。細胞株的交叉污染，常在不經(jīng)意的實驗疏失（不同細胞株分盤時，共享一瓶培養(yǎng)基、槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細胞株之間的混合污染，或是實驗操作人員錄入錯誤細胞株名稱，繼代時的培養(yǎng)皿，冷凍細胞時的凍存管）中發(fā)生，而造成錯誤后續(xù)數(shù)據(jù)搜集；目前大部分的科學(xué)期刊都已有“細胞相關(guān)實驗論文發(fā)表前，均需附上細胞鑒定報告”的規(guī)定（可查閱：文章發(fā)表前要求提供細胞鑒定的雜志），以此保證數(shù)據(jù)來源的正確性。

目前常用的細胞身份驗證的方式包括：短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、同功酶分析、染色體組分型、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前國際細胞庫（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于細胞株身份鑒定方法。

三、細胞老化了

無論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養(yǎng)過程中細胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會出現(xiàn)特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。

老化細胞不會立即死亡，但其基因表達會發(fā)生變化，如果細胞老化現(xiàn)象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復(fù)蘇細胞。

圖1： 實心箭頭指示的是發(fā)生細胞老化的HEK293細胞，SA-β-gal染色陽性，而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細胞。

圖2： 被染上藍色的是發(fā)生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細胞。

由圖片可以看出老化細胞體積增大、細胞扁平。

分析了這么多~

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