電泳中的異常現(xiàn)象及其原因分析

跑電泳是分子生物學(xué)實驗的一項基本技術(shù)。只要做分子生物學(xué)方面的實驗，可能或多或少，或早或晚都要跑跑電泳。有時候，跑電泳跑著跑著也會出現(xiàn)一些奇奇怪怪的現(xiàn)象。下面，談一談跑電泳的過程中可能會發(fā)生的異?，F(xiàn)象，可能的原因，以及處理的方法。

1. 加樣孔有熒光 

下圖的紅框部分就是一個典型的加樣孔有熒光的例子。發(fā)生這種現(xiàn)象可能的原因如下：

首先一定有 DNA 的滯留，其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會被 EB 染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組 DNA  (>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。更多的時候，是比較大的 DNA 與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔而在孔中產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒有經(jīng)過純化去除酶，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光，其原因是酶與 核酸幾乎都有比較強的結(jié)合能力(基因組 DNA 的 PCR 產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強度與體系的特異性成反比)。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起。

那么，這么多種可能性。到底是什么東西殘留呢？過往的經(jīng)驗是：蛋白質(zhì)殘留的熒光有點發(fā)悶，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。如上面那個例子，這么亮，這么銳利，肯定不會是蛋白質(zhì)啦。

2.總 RNA 非變性電泳顯示 28S 不如 18S 亮 

如下圖所示，18S 明顯地比 28S 亮了。

如果 28S 和 18S 的條帶清晰無彌散，那么多提示 28S 沒有被 EB 飽和。RNA 殘留多時，基 因組 DNA 的電泳也會有相似現(xiàn)象。解決方法：簡單的補染就可以解決此問題。再次電泳時， 或者降低上樣量，或者直接增加膠中 EB 的量。保證 28S 比 18S 亮堂很多很多。

3. 降解 

降解的現(xiàn)象，其實是千奇百怪的?？梢院唵慰偨Y(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。如果同時還伴隨下列的一個或者多個現(xiàn)象，則需要更進一步的檢測：加樣孔非常的亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個方向、從加樣孔即開始發(fā)生彌散。 如下圖所示，紅框里面的就是典型的降解的現(xiàn)象。

其實，以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言，降解的發(fā)生主要是在*勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。以總 RNA 抽提為例，總 RNA 的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細胞、貼壁 細胞、組織。*裂解懸浮細胞的時間最短，*裂解組織的時間最長，這就是降解多發(fā)生在*勻漿之前的一個佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量；但是，有許多實驗室并不具備嚴格的保存手段，實驗人員的操作也并非完好，其結(jié)果就是核酸的降解。

事實上，RNA 抽提受的影響因素太多，就以基因組 DNA 的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻*，可以預(yù)期的降解為：細胞：不應(yīng)該降解，碾碎的組織：不應(yīng)該降解，大塊組織：部分降解。如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象是假象；如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了。即使蛋白酶 K 失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細胞的基因組 DNA 在抽提過程中間不被降解。

說了這么多。那么，如何才能減少或者杜絕核酸降解呢？那就是：一定要將重點放在樣品被*勻漿之前。樣品的保存在前面寫的 RNA 的提取一節(jié)里面已經(jīng)說過了，不重復(fù)。其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或者低溫到被*勻漿之間的時間。越快越好。