一篇就夠了，帶你了解高通量測序！

說到近十年來發(fā)展最迅猛的生物技術(shù)，首先想到了高通量測序,我們研究基因組學(xué)都離不開它。目前，高通量測序已經(jīng)深入到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，不僅有力地推動了基礎(chǔ)研究的發(fā)展，也在逐漸征服臨床應(yīng)用。

所謂的高通量測序技術(shù)，又名大規(guī)模平行測序，是將 DNA（或者 cDNA）隨機(jī)片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫中數(shù)以萬計(jì)的克隆(colony)進(jìn)行延伸反應(yīng)，檢測對應(yīng)的信號，最終獲取序列信息。與 Sanger 法為代表的傳統(tǒng)測序法相比，高通量測序技術(shù)在處理大規(guī)模樣品時(shí)具有顯著的優(yōu)勢，又快（兩天）又多（數(shù)百萬克?。?，成為目前組學(xué)研究的主要技術(shù)。

當(dāng)前主要的測序技術(shù)平臺，主要分為： 

*solexa 測序技術(shù)（即大家耳熟能詳?shù)?illumina 測序平臺）； 

*454 測序技術(shù)（讀長長，但是準(zhǔn)確度較低，成本較高，即焦磷酸測序技術(shù)，少量市場占有）； 

*solid 測序技術(shù)（雙色編碼技術(shù)，目前基本在市場上見不到了）。

那么高通量測序技術(shù)可以幫助我們做到什么呢？

首先是基因組層面的應(yīng)用。 

對于疾病診斷領(lǐng)域，全基因組重測序技術(shù)是一種非常有力的手段。所謂的全基因組重測序，即對基因組序列已知物種的個(gè)體（比如人，小鼠等）進(jìn)行基因組測序，并進(jìn)行差異信息分析的方法。基于全基因組測序，可以快速的尋找到大量的遺傳差異，從而實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測，找到大量的 SNP，InDel，結(jié)構(gòu)變異（SVs）等變異信息，從而獲取生物群體的遺傳特征。臨床上，常規(guī)的產(chǎn)前診斷技術(shù)是需要通過穿刺（絨毛穿刺、羊膜腔穿刺等）的方法取得胎兒的組織進(jìn)行遺傳學(xué)檢測，這可能導(dǎo)致一定的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。而在 1997 年，Lo 團(tuán)隊(duì)[1]發(fā)現(xiàn)了孕婦外周血中存在有胎兒的游離 DNA，而高通量測序技術(shù)可以針對短序列 DNA 進(jìn)行精準(zhǔn)的測序。2010 年，Lo 團(tuán)隊(duì)借助測序技術(shù)完成了母血中胎兒的全部組基因組圖譜的繪制[2]，證實(shí)了利用 cffDNA(cell free fetal DNA)進(jìn)行胎兒基因檢測是*可行的。

目前應(yīng)用高通量測序技術(shù)的三體綜合征產(chǎn)前基因診斷技術(shù)已經(jīng)開展臨床試點(diǎn)。

在動物學(xué)研究方面，Xia 等人[3]運(yùn)用新一代測序技術(shù)對 29 種家蠶(Bombyx mori)和 11 種野 蠶(Bombyx mandarina)進(jìn)行了基因組重測序, 構(gòu)建了一個(gè)單堿基分辨率的家蠶遺傳變異圖譜.  每個(gè)個(gè)體測序約 3X, 覆蓋基因組序列的 99.88%, 鑒定出 1600 多萬個(gè) SNPs, InDels 和 SVs。 分析結(jié)果表明，馴化家蠶由野生蠶分化而來，且在馴養(yǎng)過程中，人為選擇優(yōu)良品種，性狀相 對單一。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了 354 個(gè)受到馴化和人工選擇壓力影響的蛋白編碼基因，主要參與調(diào)控蠶的絲蛋白合成，能量代謝，生殖特性和飛行能力。

一個(gè)人樣品的全基因組測序，目前的價(jià)格在 1.3 萬人民幣左右。然而大量的基因組區(qū)域是不編碼蛋白質(zhì)的，甚至對于特定疾病或者表型來說，參與調(diào)控的關(guān)鍵基因是已知的，所以研究者更關(guān)心的是某一個(gè)特定區(qū)域的表達(dá)情況。這時(shí)候，外顯子組和目標(biāo)區(qū)域測序就非常適合了。所謂的外顯子組(exome)是一個(gè)物種基因組中全部外顯子區(qū)域的總和，通過探針法捕獲基因組中全部外顯子序列，然后使用高通量測序技術(shù)對外顯子組測序，可以直接的發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)的遺傳突變。相對于全基因組測序，外顯子測序更加的經(jīng)濟(jì)，只需 9000 人民幣。而對于感興趣的特定基因組區(qū)域，可以進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的深度測序。這就更便宜了，200 個(gè)擴(kuò)增子（產(chǎn)物長度<300bp），如果來自同一個(gè)模板，則只需 400 塊！

那么，除了以上介紹的兩種主流的基因組測序方法之外，還衍生出了其他的分析方法，比如簡化基因組測序，可以對重要的和復(fù)雜性高的 QTLS（quantitative trait loci,數(shù)量性狀位點(diǎn)）精細(xì)定位。簡化代表文庫測序，對群體中不同基因型的個(gè)體采用相同的內(nèi)切酶酶切，回收相同大小范圍的酶切片段并測序，可以降低基因組分析的復(fù)雜性。酶切位點(diǎn)相關(guān) DNA 測序（RADseq）等一些新興的測序分析技術(shù)。

在基因組分析上更進(jìn)一步，我們會對基因表達(dá)，可變剪切，基因結(jié)構(gòu)變化等內(nèi)容感興趣。所以我們需要使用到轉(zhuǎn)錄組測序，即 RNA-seq。即從總的 RNA 中富集出單鏈 mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成雙鏈 cDNA，隨后進(jìn)行高通量測序，并與基因組 DNA 序列進(jìn)行比對。比如，Gruber 等[4] 對 14 例兒童非唐氏綜合征急性巨核細(xì)胞白血病患者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)隱匿的 16 號染色體倒位，inv(1 6)(P13．3 q24．3)，形成 CBFA2T3 一 GLIS2 融合蛋白，CBFA2T3-GLIS2 在果蠅和鼠的造血細(xì)胞里的表達(dá)能夠誘導(dǎo)成骨蛋白信號系統(tǒng)的激活，從而促進(jìn)造血祖細(xì)胞的自我更新，研究結(jié)果表明 CBFA2T3-GLIS2 融合蛋白的表達(dá)可能促進(jìn)白血病的發(fā)生。Zhang 等人 [4]以水稻 9311 的愈傷組織、根尖、莖尖、葉、稻花/稻穗為材料, 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序, 展示了栽培水稻不同器官的轉(zhuǎn)錄組圖譜. 采用高通量雙末端測序, 檢測到了 7232 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本, 這些轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度低, 且具有組織特異性. 共發(fā)現(xiàn)了 23800 個(gè)可變剪接，說明轉(zhuǎn)錄融合事件比我們原來預(yù)想的要更加的常見。

通過 RNA-seq，還可以發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄物。長鏈非編碼 RNA(lncRNA)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，其功能廣泛，涉及到個(gè)體發(fā)育、干細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展等眾多方面。最早的大規(guī)模發(fā)掘 lncRNA 的工作是通過芯片完成的，但是后來人們發(fā)現(xiàn)，高通量測序特別適合用于發(fā)掘新的 lncRNA。近年來，在人、小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚、豬等物種中，通過 RNA-seq， 發(fā)現(xiàn)了一大批的 lncRNA。進(jìn)一步研究證實(shí)有的 lncRNA 具有調(diào)控各種生物過程的能力。這方面的工作比較簡單，也形成了一定的套路，對于廣大的生命科學(xué)研究人員來說是較容易出成果的一個(gè)領(lǐng)域。

除 lncRNA 外，環(huán)狀 RNA（circular RNAs ,circRNAs）研究也是 RNA-seq 的一個(gè)重要應(yīng)用方向。circRNAs 是一類特殊的非編碼 RNA 分子，也是 RNA 領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的線性 RNA （linear RNA，含 5’和 3’末端）不同，circRNA 分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受 RNA 外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。有研究表明 circRNA 可能通過 miRNA-sponge 的方式來調(diào)控 miRNA 對靶基因的抑制作用，在某些疾病中具有重要意義。通過 RNA-seq，可以找到融合(fusion)的序列接口，從而發(fā)掘新的 circRNA。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)得到了許多重要的應(yīng)用。

同時(shí)，我們也常常用到 DGE（digital gene expression）技術(shù)。其基本原理是對 cDNA 進(jìn)行雙酶切，從而每一條 mRNA 都會得到一個(gè)對應(yīng)的標(biāo)簽，隨后進(jìn)行高通量測序，比較不同樣本之間各種標(biāo)簽的數(shù)目，從而找出差異化的標(biāo)簽，即差異化的 mRNA。

microRNA 測序也是目前常用的測序項(xiàng)目。microRNA 是一類內(nèi)源小分子 RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平，負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來發(fā)揮作用，控制了多種生物和代謝途徑中眾多基因的表達(dá)，在生物生長和發(fā)育中扮演重要角色，目前 microRNA 測序技術(shù)普遍用于動植物表觀遺傳學(xué)研究。

除以上介紹的測序技術(shù)之外，常用的測序技術(shù)還有： 

MeDIP-Seq 技術(shù)（methylation DNA immunoprecipitationsequencing，甲基化 DNA 免疫共沉淀)，是研究甲基化的一種有效的手段。由于在哺乳動物中甲基化一般發(fā)生在 CpG 的胞嘧啶 5 位碳原子上，所以可通過特異性結(jié)合甲基化 DNA 的蛋白 MBD2b 或 5’-甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的 DNA 片段，并結(jié)合第二代高通量測序，對富集到的 DNA 片段進(jìn)行測序，從而檢測全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)。

ChIP-seq,染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，研究體內(nèi)蛋白與 DNA 相互作用的一種方法先通過 ChIP 特異性地富集與目的蛋白相結(jié)合的 DNA 片段, 而后對所得 DNA 片段進(jìn)行高通量測序。

總體來說，高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降。但是同時(shí)由于數(shù)據(jù)量的大幅度上升，全基因組測序臨床應(yīng)用的瓶頸在于信息的分析和解讀能力不足。如何更好的分析數(shù)據(jù)，挖掘數(shù)據(jù)，驗(yàn)證結(jié)果，隨之而來的生物信息學(xué)解決方案可以為基因組學(xué)研究帶來更大的機(jī)遇。

參考文獻(xiàn): 

[1] Lo Y M, Corbetta N, Chamberlain P F, et al. Presence of fetal DNA  in maternal plasma and serum[J] .Lancet, 1997,350(9076):485-487

[2] Lo Y M, Chan K C, Sun H, et al. Maternal plasma DNA sequencing  reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus  [J]. Sci Transl Med, 2010,2(61):61r-91r

[3] Xia Q, Guo Y, Zhang Z, et al. Complete resequencing of 40 genomes  reveals domestication events and genes in silkworm (Bombyx). Science,  2009, 326: 433–436

[4]Gruber TA, Larson GedmanA, Zhang J, et al. An lnv(16)(p13,3q24.3)- encoded CBFA2T3-GLIS2 fusion protein defines an aggressive subtype of  podiatric acute megakaryoblasticleukemia[J]. Cancer Cell, 2012,  22(5):683-697