RNA轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)方法選擇和步驟

正規(guī)化管理的實(shí)驗(yàn)室都會(huì)給新人進(jìn)行相關(guān)技能體系的培訓(xùn)，但是被老板散養(yǎng)的研究僧或者無奈從 0 開始做科研的臨床醫(yī)生也不在少數(shù)。他們在初始接觸分子實(shí)驗(yàn)時(shí)，手持《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》這本寶典，很容易被五花繚亂的實(shí)驗(yàn)方法亂了陣腳······

連轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據(jù)自己的實(shí)際情況各取所需呢？首先，明確自己的定位，你目前要解決的是單個(gè)問題而不是一口吃成一個(gè)大胖子，然后關(guān)鍵是明確實(shí)驗(yàn)對象和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nbsp;

舉個(gè)栗子，現(xiàn)在手頭上的樣本是某個(gè)類型腫瘤臨床患者切除的組織，目的是檢測這些樣本與正常組織樣本中幾個(gè)“明星分子（如 P53 等與癌癥密切相關(guān)的分子）"是不是有差異表達(dá)，該怎么做？

1.明確自己最后一步實(shí)驗(yàn)是什么 

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，最后一步的?shí)驗(yàn)其實(shí)已經(jīng)確定了，就是從分子層面比較不同樣本中幾個(gè)基因的表達(dá)，但是分子層面可以是 RNA 轉(zhuǎn)錄水平，也可以是蛋白質(zhì)表達(dá)水平。作為新人，自然選擇前者，因?yàn)榻?jīng)打聽和查資料后我發(fā)現(xiàn)，RNA 轉(zhuǎn)錄使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）方法就好，容易上手出結(jié)果快，而對比蛋白質(zhì)表達(dá)水平的 Western Blot（WB），在抗體成本和摸索實(shí)驗(yàn)體系的時(shí)間成本上都不合算（當(dāng)然，很多實(shí)驗(yàn)中如果 RNA 轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)差異，還是很有必要在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證的）。 

所謂 qPCR 技術(shù)，是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR 從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。

2.找出所有涉及到的分子實(shí)驗(yàn) 

從最后一步實(shí)驗(yàn)往前推，qPCR 需要哪些基本的元素？具體如下： 

*qPCR 的模板→當(dāng)然不能直接用腫瘤組織和正常組織→查資料發(fā)現(xiàn)模板是 cDNA→怎么制備 cDNA？→提取所有組織樣本的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，RT-PCR）→我需要 RNA 抽提試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒→完成 RNA 的提取和 cDNA 的合成（放心，試劑盒里都會(huì)有非常具體的操作說明書，但是自己要多查資料了解原理，不然你和流水線操作員何異？） 

*qPCR 的引物→根據(jù)已經(jīng)確定的分子自己使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)或者查找文獻(xiàn)找到經(jīng)過驗(yàn)證的引物，不要忘了 GAPDH 或者其他內(nèi)參的引物 

*SYBR® GREEN→商業(yè)試劑盒 

*酶→包含在 SYBR® GREEN 試劑盒中 

*RNase-free H2O→一般在 SYBR® GREEN 中會(huì)有對應(yīng)的 H2O，小伙伴們千萬不要使用正常 PCR 中使用的高溫滅菌 H2O，否則溶解曲線讓你分分鐘想撞墻。

3.Just do it 

根據(jù) SYBR® GREEN 試劑盒說明書中的體系要求完成實(shí)驗(yàn)操作（冰上操作）和對 qPCR 儀器的設(shè)置，具體儀器的使用方法一定要多多問別人。