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RNA轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)方法選擇和步驟
發(fā)布時(shí)間: 2021-08-27 點(diǎn)擊次數(shù): 1452次正規(guī)化管理的實(shí)驗(yàn)室都會(huì)給新人進(jìn)行相關(guān)技能體系的培訓(xùn),但是被老板散養(yǎng)的研究僧或者無(wú)奈從 0 開(kāi)始做科研的臨床醫(yī)生也不在少數(shù)。他們?cè)诔跏冀佑|分子實(shí)驗(yàn)時(shí),手持《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》這本寶典,很容易被五花繚亂的實(shí)驗(yàn)方法亂了陣腳······
連轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據(jù)自己的實(shí)際情況各取所需呢?首先,明確自己的定位,你目前要解決的是單個(gè)問(wèn)題而不是一口吃成一個(gè)大胖子,然后關(guān)鍵是明確實(shí)驗(yàn)對(duì)象和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?nbsp;
舉個(gè)栗子,現(xiàn)在手頭上的樣本是某個(gè)類(lèi)型腫瘤臨床患者切除的組織,目的是檢測(cè)這些樣本與正常組織樣本中幾個(gè)“明星分子(如 P53 等與癌癥密切相關(guān)的分子)"是不是有差異表達(dá),該怎么做?
1.明確自己最后一步實(shí)驗(yàn)是什么
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模詈笠徊降膶?shí)驗(yàn)其實(shí)已經(jīng)確定了,就是從分子層面比較不同樣本中幾個(gè)基因的表達(dá),但是分子層面可以是 RNA 轉(zhuǎn)錄水平,也可以是蛋白質(zhì)表達(dá)水平。作為新人,自然選擇前者,因?yàn)榻?jīng)打聽(tīng)和查資料后我發(fā)現(xiàn),RNA 轉(zhuǎn)錄使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qPCR)方法就好,容易上手出結(jié)果快,而對(duì)比蛋白質(zhì)表達(dá)水平的 Western Blot(WB),在抗體成本和摸索實(shí)驗(yàn)體系的時(shí)間成本上都不合算(當(dāng)然,很多實(shí)驗(yàn)中如果 RNA 轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)差異,還是很有必要在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證的)。
所謂 qPCR 技術(shù),是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR 從定性到定量的飛躍,它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。
2.找出所有涉及到的分子實(shí)驗(yàn)
從最后一步實(shí)驗(yàn)往前推,qPCR 需要哪些基本的元素?具體如下:
*qPCR 的模板→當(dāng)然不能直接用腫瘤組織和正常組織→查資料發(fā)現(xiàn)模板是 cDNA→怎么制備 cDNA?→提取所有組織樣本的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),RT-PCR)→我需要 RNA 抽提試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒→完成 RNA 的提取和 cDNA 的合成(放心,試劑盒里都會(huì)有非常具體的操作說(shuō)明書(shū),但是自己要多查資料了解原理,不然你和流水線操作員何異?)
*qPCR 的引物→根據(jù)已經(jīng)確定的分子自己使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)或者查找文獻(xiàn)找到經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的引物,不要忘了 GAPDH 或者其他內(nèi)參的引物
*SYBR® GREEN→商業(yè)試劑盒
*酶→包含在 SYBR® GREEN 試劑盒中
*RNase-free H2O→一般在 SYBR® GREEN 中會(huì)有對(duì)應(yīng)的 H2O,小伙伴們千萬(wàn)不要使用正常 PCR 中使用的高溫滅菌 H2O,否則溶解曲線讓你分分鐘想撞墻。
3.Just do it
根據(jù) SYBR® GREEN 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的體系要求完成實(shí)驗(yàn)操作(冰上操作)和對(duì) qPCR 儀器的設(shè)置,具體儀器的使用方法一定要多多問(wèn)別人。
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