【技術(shù)】教你如何達(dá)到提取RNA的最高境界！

免除 RNase 的困擾 

RNA 分子異常脆弱，很容易就會被無處不在的 RNase 降解，輕輕松松的就讓實(shí)驗(yàn)人員的種種努力付之東流。尤其是當(dāng)樣品極其稀少且珍貴時，RNA 的降解更是讓各位小伙伴們想自掛東南枝。因而 RNase 可謂是 RNA 提取的大敵，那么為了保護(hù)好 RNA 分子，就必須 把 RNase 給 KO 掉。

當(dāng)然針對外來的敵人，只要注意這三個小細(xì)節(jié)，那么絕對可以克敵制勝。 

（1）嚴(yán)格戴好口罩、手套。手指和呼吸是外源性 RNase 的主要來源，所以在提取 RNA 時，一 定全副武裝起來，才好擒獲 RNA 分子。 

（2）實(shí)驗(yàn)中所涉及的離心管、槍頭、移液器、實(shí)驗(yàn)臺面一定要經(jīng)過*處理。比如，離心管和槍頭要用 0.1%DEPC 浸泡后并高壓滅菌處理，移液器、實(shí)驗(yàn)臺面要用 75%的酒精擦拭過， 玻璃器皿應(yīng)在使用前用 180℃的高溫下干烤 6h 或更長時間。 

（3）實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。另外，還需要注意 RNA 的保存時間，一般 RNA 37℃穩(wěn)定存放 1 天，25℃穩(wěn)定存放一周，4℃可存放一個月或-20℃長期存放。

可是有時即便小伙伴已經(jīng)如此小心翼翼了，RNA 分子仍會消失的無影無蹤，細(xì)究其原因，才發(fā)現(xiàn)竟是內(nèi)源性 RNase 在搞鬼，這不禁讓人感嘆道，不是我們太粗心，實(shí)在是敵人太狡猾。為了打擊內(nèi)源性 RNase 的囂張氣焰，我們只能千方百計的滅活內(nèi)源酶，因而便誕生了以下三個妙招。

1、選擇合適的勻漿方法。新鮮樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可移至-70℃冰箱中保存。在碾磨前，碾磨用具也必須預(yù)冷。在碾磨過程中，一邊碾磨，一邊補(bǔ)充液氮。樣品碾碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。 

2、選擇合適的裂解液。現(xiàn)有市場上常用的裂解液幾乎都能抑制 RNase 活性。但是高內(nèi)源酶含量的樣品，如肝臟、脾臟等組織，建議使用含苯酚的裂解液。苯酚的滅活內(nèi)源酶的能力還是很強(qiáng)的。 

3、控制好樣品的起始量。如果樣品的個頭太大，細(xì)胞中就會有些“漏網(wǎng)之魚"免于和裂解液接觸，致使 RNA 很快就會被內(nèi)源酶降解。因而，起始量不要太大，如果組織塊過大，可以將切碎后再抽提 RNA。

明確抽提 RNA 的目的 

一般，抽提 RNA 的目的無外乎有兩個。首先，最直接的目的就是要讓 RNA *地完整的釋放出來。此時對樣品的處理就至關(guān)重要，如果樣品是細(xì)胞，則無須破碎即可直接勻漿；如果是組織甚至器官，那就需要破碎后才能勻漿；如果是酵母菌和細(xì)菌，則需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。 

其次，RNA 在不同的實(shí)驗(yàn)中其質(zhì)量的要求是不一樣的，那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)就是我們必須要考慮的。通常 cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因而，不用每次實(shí)驗(yàn)都以獲得最高純度的 RNA 為目的，從而造成不必要的浪費(fèi)。

RNA 提取之疑難雜癥 

1、RNA 產(chǎn)量低

2、OD260/OD280<1.6

3、基因組 DNA 污染

4、RNA 降解

5、下游的 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)不成功

RNA 電泳圖譜剖析 

提取RNA后，為了更好的進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)需要通過瓊脂糖電泳來判斷RNA質(zhì)量的好壞。在此，將剖析電泳圖上的秘密，幫助大家提高 RNA 抽提的成功率。

1、RNA 條帶不亮或缺失

原因分析：（1）上樣量不足。（2）RNA 跑出凝膠。電泳至溴酚藍(lán)至凝膠的 2/3 即可停止電泳。（3）RNA 在凝膠中發(fā)生擴(kuò)散。避免長時間的電泳，否則小片段容易擴(kuò)散。（4）RNA 降解。最大限度減少在紫外線下暴露的時間，使用新鮮的電泳緩沖液、新制的凝膠，電泳槽及制膠的模具梳子等用雙氧水浸泡，高電壓短時間電泳（20min）。也可能使用的組織材料不夠新鮮（冷凍的材料必須在化凍之前將其磨碎）。

2、RNA 條帶彌散

原因分析：（1）RNA 被核酸酶降解。要用新的緩沖液，制膠用的模具要清潔，槍頭要滅菌。（ 2）電壓過高造成電流過大所造成的。一般為 5—8V/cm。為了增加條帶的清晰度，電泳開始的幾分鐘建議使用低電壓。（3）上樣量過大。根據(jù)沉淀量的多少確定點(diǎn)樣的量，一般 1—3ul。

3、點(diǎn)樣孔發(fā)亮

原因解析：（1）上樣量過大。（2）膠孔未凝固好，使樣品無法往前移動。（3）RNA 樣品中含有污染物，如殘留的蛋白質(zhì)容易引起此現(xiàn)象?？赡?trizol 量太少，應(yīng)加大 trizol 用量。另外若殘留 DNA 也應(yīng)考慮加大 trizol 用量。

4. 出現(xiàn)多條帶

原因解析：（1）RNA 降解。提取過程中出現(xiàn)降解或電泳過程中出現(xiàn)降解（可能性較?。?。（2） 上樣量過大。RNA 由多種類型組成，若上樣量過大則會導(dǎo)致各種類型的 RNA（tRNA，mRNA 等）均會出現(xiàn)條帶。