酵母雜交實(shí)驗(yàn)——從一無(wú)所知到略知一二

低分文章要想逆襲，實(shí)現(xiàn)向高分文章的跳躍，就一定少不了要將細(xì)胞豪門(mén)中分子間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系屢屢清楚。為了找尋能讓自家目的蛋白榮登科研“頭條榜"的“花邊新聞"，一眾科研者可謂是操碎了心。慶幸的是，酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）和酵母單雜交（Yeast One-Hybrid，Y1H）實(shí)驗(yàn)讓蛋白質(zhì)與其好友（蛋白質(zhì)、DNA、RNA）的關(guān)系在科研者面前變得無(wú)所遁形。

蛋白釣魚(yú)術(shù)——酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）

通常一個(gè)蛋白在本性上可以同時(shí)喜歡很多其他的蛋白，但最終還是會(huì)有個(gè)最喜歡的，而在 Y2H 中就能發(fā)現(xiàn)他的喜好。換言之，Y2H 就是研究一群男女間的自由戀愛(ài)問(wèn)題，而它為兩個(gè)蛋白牽線拉橋的方法，簡(jiǎn)單概括起來(lái)就一句話：廣撒網(wǎng)，釣大魚(yú)。

首先，把目的基因構(gòu)建成 DNA 結(jié)合質(zhì)粒（BD 質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入 a 型酵母中形成釣餌（Bait）；其次將全 cDNA 片段構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄激活質(zhì)粒（AD 質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化到 b 型酵母中，每個(gè) b 型酵母含有一個(gè)隨機(jī)的 AD 質(zhì)粒，就形成了酵母庫(kù)；最后利用酵母接合生殖的特征使得 AD 和 BD 兩個(gè)質(zhì)粒 同時(shí)進(jìn)入到一個(gè)酵母中，當(dāng)目的蛋白和酵母庫(kù)中 AD 質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白相“合拍"時(shí)，質(zhì)粒上的氨基酸合成基因就會(huì)被啟動(dòng)激活，使得酵母可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了，這樣就 弄清楚誰(shuí)才是目的蛋白的“命中真愛(ài)"了。 

然而在 Y2H 中，由于酵母庫(kù)的構(gòu)建是通過(guò) cDNA 片段鏈接到質(zhì)粒上的，經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生 2/3 移碼突變的假陽(yáng)性。因而，在研究蛋白質(zhì)互作過(guò)程中，在用 Y2H 來(lái)篩選出相關(guān)蛋白后，還需用 Co-IP 和 GST pulldown 進(jìn)行驗(yàn)證，看看目的蛋白對(duì)“真愛(ài)"是否做到了“沒(méi)有你不行"又或者可能“腳踏兩只船"還擁有其他的新伙伴。總之，只有依靠縝密的陰性、陽(yáng)性對(duì)照才能真正在蛋白實(shí)驗(yàn)中披沙揀金、去偽存真。

DNA 識(shí)別者——酵母單雜交（Yeast One-Hybrid，Y1H）

而一提及蛋白質(zhì)與 DNA 之間千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，各位小伙伴立刻會(huì)向 ChIP-qPCR，ChIP-RNAseq 或熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等“神助攻"來(lái)尋求幫助。 

可是你造么？通過(guò)酵母單雜交（Y1H），可快速鑒定與感興趣的特定調(diào)節(jié) DNA 序列（bait 序列）相互作用的蛋白質(zhì)，除了“明星蛋白"異源轉(zhuǎn)錄因子，還可找到一些其他“幕后英雄"，如 DNA 復(fù)制蛋白、修復(fù)蛋白及抑制蛋白。更重要的是，Y1H 還有著一項(xiàng)得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)：可檢測(cè)蛋白異構(gòu)體（isoform）與 DNA 特異性相互作用，而這正是依賴于敏感和特異性抗體綁定到特定靶蛋白的 ChIP 很難做到的。

舉個(gè)栗子，當(dāng)通過(guò)各類(lèi)芯片篩選出了一個(gè)在腫瘤組織中異常高表達(dá)的差異基因 A，可通過(guò) Y1H 實(shí)驗(yàn)為其組織一場(chǎng)相親大會(huì)：即將構(gòu)建含有報(bào)告基因（基因 A 作為 Bait 序列）的酵母單細(xì)胞株，與后續(xù)導(dǎo)入該菌株的表達(dá)特定蛋白的表達(dá)質(zhì)粒庫(kù)“見(jiàn)面"，如果某蛋白能與上游的 Bait 序列“情孚意合"，可使融合激活結(jié)構(gòu)域（AD）與報(bào)告基因的啟動(dòng)子元件緊密接近，從而激活報(bào)告基因的下游轉(zhuǎn)錄，使得酵母可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。接下來(lái)就可對(duì)該蛋白調(diào)控基因 A 的機(jī)制進(jìn)行深入研究。 

然而，任何篩選都存在假陽(yáng)性，Y1H 也不例外；且 Y1H 不提供關(guān)于 DNA-蛋白質(zhì)相互作用的功能性后果的任何信息。可見(jiàn)在生物實(shí)驗(yàn)中，單一的證據(jù)都是薄弱的，無(wú)論它貌似多么正確，也要通過(guò)對(duì)照和多方取證才能確定真正的事實(shí)。 

升級(jí)版——酵母三交技術(shù)（Yeast Three-hybrid，Y3H）

目前，從基本科學(xué)和臨床角度上，通過(guò) Y3H 來(lái)理解與 RNA 病毒相關(guān)的疾病過(guò)程是很重要的。而在具體的實(shí)踐過(guò)程中，Y3H 可以用于篩選 RNA 文庫(kù)以及 cDNA 文庫(kù)。由于 Y3H 在現(xiàn)階段還是一種新技術(shù)，所以迄今為止對(duì)其的相關(guān)報(bào)道還是比較少的。

參考文獻(xiàn)： 

1）An Overview of Yeast Two-Hybrid (Y2H) Screening 

2）An overview of the Yeast one-hybrid assay 

3）Two Hybrid Services