CO-IP沒有條帶的常見原因和解決的辦法

CO-IP 并不容易做，尤其是兩個蛋白豐度低，相互作用力較弱的時候。做 CO-IP 經(jīng)常會遇到?jīng)]有條帶的問題。這里談?wù)?CO-IP 沒有條帶的常見原因和解決的辦法，更有獨(dú)門配方獻(xiàn)上。

蛋白濃度過稀 

絕大多數(shù)情況下，CO-IP 沒有條帶是由于蛋白濃度過稀。裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。但是，有些實(shí)驗(yàn)室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做 CO-IP。其實(shí)，在大多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細(xì)胞裂解液。盡量使細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達(dá) 7-8 mg/ml 左右。這才會避免發(fā)生沒有條帶的情況。

沒有裂解開 

很多時候，由于裂解液不夠強(qiáng)烈，蛋白質(zhì)復(fù)合物沒有分開，也會造成沒有條帶的問題。解決辦法是：加溫和加少量的 SDS 增加變性能力。這里再介紹一個小竅門：最初幾遍的漂洗 buffer 要和 IP 時的鹽濃度相同。純化蛋白的時候，如果用低鹽裂解細(xì)胞，高鹽漂洗去雜質(zhì)，蛋白丟失較多。再奉獻(xiàn)一個獨(dú)門配方：20 mM Tris/HCl，pH7.6，100 mM  NaCl，20 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.5% NP-40 and protease inhibitors （0.5M PMSF）。包用包好。

量不合適

很多時候，CO-IP 沒有條帶，是由于蛋白量，珠子，抗體的量需要調(diào)整。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般 100ug 蛋白，3ug 抗體，30ug 珠子。如果不行，250ug 蛋白，5ug 抗體，或者 500ug 蛋白，7ug 抗體。

抗體太坑

抗體是 CO-IP 成敗的致命因素之一！必須是 IP 級別的抗體。說句不好聽的話，不要用國產(chǎn)抗體和 Santa Cruz 的抗體。這些抗體在做 CO-IP 的實(shí)驗(yàn)室里面已經(jīng)臭名遠(yuǎn)揚(yáng)了?？尤藷o數(shù)。大家就不要再重蹈覆轍了。 

單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強(qiáng)，背景低。但是單抗有一個致命的弱點(diǎn)，就是識別位點(diǎn)單一，而在 CO-IP 過程中，該位點(diǎn)很有可能與其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識別靶蛋白而沒有條帶。所以，如果沒有十足把握，單抗的識別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域，還是選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。至少不會出現(xiàn)沒有條帶的問題。

細(xì)胞數(shù)量太少 

很多時候，CO-IP 沒有信號是由于細(xì)胞數(shù)量太少。一般是 145 mm 的培養(yǎng)皿，至少要長到 50%以上。如果低于這個數(shù)目，CO-IP 就很有可能沒有信號。除非藥品和試劑非常非常昂貴，否則就不要節(jié)約這點(diǎn)細(xì)胞了。一旦 CO-IP 實(shí)驗(yàn)失敗，浪費(fèi)的時間可是更寶貴的。

綜上所述，CO-IP 是比較難做的一個實(shí)驗(yàn)。很多時候，能否成功取決于抗體和兩個蛋白的結(jié)合常數(shù)，和 protocol 和實(shí)驗(yàn)操作本身的關(guān)系不大。以上，介紹了一些經(jīng)驗(yàn)體會和小技巧小竅門，希望對大家有所幫助。