怎么提高電穿孔法轉(zhuǎn)染的效率？

電穿孔法難點(diǎn)在于提高電穿孔的效率。實(shí)驗(yàn)操作者一般能從電轉(zhuǎn)儀廠家得到轉(zhuǎn)染的詳細(xì)方案和優(yōu)化指導(dǎo)。當(dāng)你需要自己優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率時(shí)，可以從以下方面進(jìn)行：

1、外加電場(chǎng)的強(qiáng)度：電壓過(guò)低，細(xì)胞膜不能形成小孔，使得外源分子通過(guò)；電壓過(guò)高，細(xì)胞會(huì)受到不可逆損傷，以至于裂解。對(duì)于大部分哺乳細(xì)胞來(lái)說(shuō)，電壓250～500V/cm是合適的。實(shí)驗(yàn)操作者需要查詢(xún)資料，找到所需細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的合適電場(chǎng)強(qiáng)度。

這部分的操作建議通過(guò)逐級(jí)增加電壓來(lái)確定*佳轉(zhuǎn)染電場(chǎng)強(qiáng)度。

2、電脈沖時(shí)間的長(zhǎng)短：一般電脈沖只進(jìn)行1次。根據(jù)電轉(zhuǎn)儀的具體參數(shù)設(shè)置，不同儀器間差異較大。

3、溫度：細(xì)胞在室溫時(shí)電轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)表達(dá)水平*高；對(duì)于高強(qiáng)度電轉(zhuǎn)，產(chǎn)生大量熱量的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，將細(xì)胞保持在0°C較好，但電轉(zhuǎn)染后需要室溫孵育一段時(shí)間。

4、DNA：線性DNA比環(huán)形DNA的轉(zhuǎn)染效率高，合適濃度是1～40μg/mL。使用質(zhì)粒時(shí)，需要提高質(zhì)粒的純度。

5、培養(yǎng)基：用緩沖鹽溶液（HEPES鹽緩沖液）懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，比使用含非離子物質(zhì)（甘露糖、蔗糖）的緩沖液高數(shù)倍。

6、細(xì)胞狀態(tài)：最好使用生長(zhǎng)活躍、狀態(tài)健康、無(wú)污染、傳代次數(shù)低的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。