報告基因：β-半乳糖苷酶的原位染色實(shí)驗(yàn)方法

一、材料
非消毒物品 

1. D-PBSA

2. 底物：X-gal（nvitrogen），以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL，用多聚丙烯管-20℃ 避光保存，最長可達(dá) 6 個月 

3. 固定液：1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛，均以 PBSA 液配制；將 85 mL 水、10 mL 的 10x D-PBSA、5 mL 福爾馬林（37% 甲醛溶液）及 0.2 mL 戊二醛（25% 溶液）混合，制備成固定液，于 4℃ 儲存 

4. 染色液：含 5 mmol/L 鐵氰鉀，5 mmol/L 亞鐵氰鉀，2 mmol/LMgCl2，以 D-PBSA 配制，4℃ 儲存 

5. 底物/染色液：1 mg/mLX-gal，以染色液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配 

6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液 

7. 將β-gal 的表達(dá)質(zhì)粒作為報告基因轉(zhuǎn)染（如：pcMV β-gal ）

二、操作步驟：
1. 用 2 mL D-PBSA 液洗滌細(xì)胞（如在 6 孔培養(yǎng)板上）。

2. 用 1 mL 固定液于室溫下固定細(xì)胞 5 min。

3. 用 2 mL D-PBSA 洗滌細(xì)胞 2 次。

4. 將 1 mL 底物/染色液加入到每個培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃ 孵育 2 h。

5. 用 2 mL D-PBSA 液沖洗每孔細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)藍(lán)染（β-gal 陽性）細(xì)胞。

6. 培養(yǎng)板的儲存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的緩沖鹽溶液，室溫下固定 10 min，然后用緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞，4℃ 儲存緩沖鹽溶液。