真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟

一些真核蛋白在原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)不但行之有效而且成本低廉，然而許多在細(xì)菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下，結(jié)果使得蛋白活性低或無活性。不僅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工，例如二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進(jìn)行的裂解等等，而這些加工原核細(xì)胞則無能為力。需要表達(dá)具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于細(xì)胞膜表面的受體或細(xì)胞外的激素和酶，則更需要使用真核轉(zhuǎn)染技術(shù)。由于DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞有關(guān)技術(shù)方法的發(fā)展，使真核表達(dá)成為可能。

利用克隆化的真核基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，具有以下多種不同用途：

(1) 通過對所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)檢測或生物活性測定，確證所克隆的基因。

(2) 對所編碼的蛋白質(zhì)須進(jìn)行糖基化或蛋白酶水解等翻譯后加工的基因進(jìn)行表達(dá)。

(3) 大量生產(chǎn)從自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各種不同類型細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物合成以及在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的情況。

(5) 通過分析正常蛋白質(zhì)及其突變體的特性，闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

(6) 使帶有內(nèi)含子而不能在原核生物如酵母中正確轉(zhuǎn)錄為 mRNA的基因組序列得到表達(dá)。

(7) 揭示某些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的DNA序列元件。

DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)現(xiàn)已變成研究基因功能和組分的重要工具，已發(fā)展了很多轉(zhuǎn)染方法，并成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞。目前廣泛應(yīng)用方法有磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、病毒載體，以及陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。

進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：

克隆目的基因(經(jīng)測序驗(yàn)證)-準(zhǔn)備真核表達(dá)載體-將目的基因插入表達(dá)載體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定

下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。

一、試劑準(zhǔn)備

1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,調(diào)pH到7.4,補(bǔ)ddH2O至100ml, pH7.4，濾過除菌。

2、核酸貯存液，過濾除菌。

3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。

二、操作步驟

(一)克隆目的基因

1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并在上、下游引物的5’-端分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。

2、回收特異性擴(kuò)增片段，連入T載體。

3、轉(zhuǎn)化DH5α，質(zhì)粒制備。

4、酶切初步鑒定，測序證實(shí)。

(二) 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建：

pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗性基因，以及表達(dá)外源DNA序列所必需的所有真核表達(dá)組件。

重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

回收插入片段和pcDNA3線性片段

T4連接酶連接

轉(zhuǎn)化DH5α

質(zhì)粒制備

BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

(三)重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞：

1、 G418篩選濃度測定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對照3復(fù)孔。以10-14天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結(jié)果為200mg/L。

2、 在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到60%-80%覆蓋。一般要求，6孔培養(yǎng)皿(35mm)，每孔1-2ml培養(yǎng)基3×105細(xì)胞。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘米的細(xì)胞數(shù)量。

典型貼壁細(xì)胞平板密度

3、 SHG-44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：

(1) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之前的短時(shí)間內(nèi)，更換1ml新鮮的有血清或無血清培養(yǎng)基。

(2) 準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個(gè)細(xì)胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀釋DNA(pcDNA3、重組pcDNA3)各1.5μg 到總體積50μl(30μg/ml)。②溶液B：用HBS稀釋6μl脂質(zhì)體到終容積50μl(120μg/ml)。③混合溶液A和B，輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。

(3) 不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養(yǎng)孔一邊到另一邊)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。

(4) 37℃孵育6hr。

(5) 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2-3ml新鮮生長培養(yǎng)基。

(6) 轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

4、 G418篩選：在G418篩選濃度下持續(xù)培養(yǎng)14天后，挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3即SHG-44-vect，并設(shè)對照組細(xì)胞即SHG-44。

(一)篩選結(jié)果鑒定：

(1)基因組DNA提取→PCR鑒定外源基因

(2)SHG-44-重組pcDNA3陽性細(xì)胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝膠電泳→免疫印跡鑒定P16蛋白表達(dá)(Western-blot)。

(3)測定外源性基因?qū)HG-44細(xì)胞增殖的影響

①流式細(xì)胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細(xì)胞懸液→70%酒精固定→裂解細(xì)胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機(jī)分析G1期和G2/M、S期比例。

②細(xì)胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→5×104/孔接種24孔培養(yǎng)板→24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞→計(jì)算細(xì)胞生長抑制百分率。

③軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→104 細(xì)胞→0.3%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)→1-2周后計(jì)數(shù)不可少于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)→計(jì)算克隆形成率抑制率。

三、注意事項(xiàng)

1、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間)每種細(xì)胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細(xì)胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。

2、預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血清下進(jìn)行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分。

3、在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37℃預(yù)溫。

脂質(zhì)體/ DNA混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。