細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的正確操作方法

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇，是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的常見(jiàn)工作。

細(xì)胞凍存，是指將細(xì)胞貯存在超低溫環(huán)境中，使細(xì)胞暫時(shí)“冬眠"的技術(shù)，在需要的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇。

細(xì)胞復(fù)蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細(xì)胞快速解凍，并使細(xì)胞重新恢復(fù)生長(zhǎng)的技術(shù)。

本文將為大家介紹細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)要點(diǎn)和操作步驟。 

凍存原則為“慢凍"，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。

如果直接將細(xì)胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細(xì)胞會(huì)受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護(hù)劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。

DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

需注意的是，DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí)，將釋放大量熱量，所以凍存液需提前配制，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞。

另外，DMSO屬于致癌物質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)戴好手套，規(guī)范操作。

程序凍存液成分一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%，DMSO比例為5%~10%。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，推薦凍存液配比：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養(yǎng)細(xì)胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存。

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程中，不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升復(fù)蘇存活率，推薦密度為100~300萬(wàn)細(xì)胞/mL。

使用程序降溫盒是較為常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇，有些則不需要。

降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用。

根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒(méi)有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三。

無(wú)血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無(wú)需自己配制，無(wú)需降溫盒，大大提升了便捷性。

但是，并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測(cè)試，沒(méi)問(wèn)題后再批量應(yīng)用。

▲ 使用無(wú)血清非程序凍存液操作示意圖

在沒(méi)有凍存盒或者非程序凍存液時(shí)，可以選擇手動(dòng)梯度降溫。但手動(dòng)梯度降溫不適用于所有細(xì)胞，且效果不穩(wěn)定，同樣需要先做凍存測(cè)試。

▲ 手動(dòng)梯度降溫操作示意圖

復(fù)蘇講究“快融"，越快融化，細(xì)胞所受損傷就越小。細(xì)胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率。

步驟1：水浴鍋預(yù)熱至37℃?zhèn)溆?/strong>

步驟2：準(zhǔn)備15mL離心管，并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

步驟3：將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋

步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內(nèi)融化

步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉(zhuǎn)移至生物安全柜。用移液槍吸取細(xì)胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準(zhǔn)備好的離心管

步驟6：1200rpm離心3分鐘

步驟7：棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至新的無(wú)菌培養(yǎng)器皿中

▲ 細(xì)胞復(fù)蘇操作示意圖

做完步驟7，細(xì)胞就復(fù)蘇好了。復(fù)蘇的細(xì)胞需要一段時(shí)間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞密度低于80%時(shí)，48小時(shí)內(nèi)不要換液，待細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度等恢復(fù)正常，再進(jìn)行傳代等操作。（不要因?yàn)閺?fù)蘇后兩三天細(xì)胞狀態(tài)不好就丟棄，應(yīng)耐心等待至少一周。）

當(dāng)然，復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)很好的情況下，可以提前開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。