細(xì)胞增殖與毒性檢測實驗方法及經(jīng)驗總結(jié)-CCK8法

實驗原理：Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

一、用途：

  藥物篩選、

  細(xì)胞增殖測定、

  細(xì)胞毒性測定、

  腫瘤藥敏試驗等。

二、優(yōu)點(diǎn)：

· 使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；

· CCK-8法能快速檢測；

· CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；

· CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解； 而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；

· CCK-8法對細(xì)胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

三、所需設(shè)備及儀器：

1. 10ul，100-200ul及多通道移液器

2. 酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）

3. 96孔培養(yǎng)板

4. 二氧化碳培養(yǎng)箱

四、方法及步驟：

實驗一：細(xì)胞增殖分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)。

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復(fù)。

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入。

5、培養(yǎng)0.5-4小時:細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件（建議預(yù)實驗先摸清楚時間點(diǎn)）。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細(xì)胞毒性分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約≥5×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復(fù)。

3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)。

5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時間（例如：6、12、24、48、60、72小時）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

7、培養(yǎng)0.5-4小時:細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

五、實驗注意事項：

· 若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

· 如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

· 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。

· 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

· 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測定孔用。

· 在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

· 金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

· 懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。

· 加入CCK-8 時，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

·  用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經(jīng)驗總結(jié)及分享：

CCK8的說明書大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價值，因為那是反復(fù)驗證過的最佳數(shù)值。但無論如何，做這個試驗一定要摸條件。你就算再懶，這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以下言論全部以細(xì)胞毒性試驗為前提， 如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長的藥物的藥效實驗?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。

摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長時間；3、加藥后的孵育時間；4、cck8試劑加入量；5、cck8試劑加入后細(xì)胞孵育時間?？雌饋砗芏?，其實這就是一個實驗。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細(xì)胞和CCK8。

1、種板數(shù)：這個要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無做過，把范圍大致找出。記住還要參考說明書，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長時間細(xì)胞可貼壁*，一般貼壁生長24小時。然后還有在你的實驗時間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長情況。比如擬定考察4天的時間，那么在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因為每塊板都會設(shè)置對照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8，這個數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗最佳OD值在1.0附近，所以這個最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。是不要讓細(xì)胞長滿，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了，對藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有影響此為其一，其二生長不均勻易導(dǎo)致孔間OD值數(shù)據(jù)偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長的時間一般就直接讓它貼壁長24h，這個時間細(xì)胞已經(jīng)貼壁*，而且這樣設(shè)置時間對自己安排實驗時間也方便。沒人愿意大半夜爬起來做實驗吧。

3、加藥后的孵育時間，試了3個時間，24h，48h，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇最合適的時間。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個問題：假設(shè)要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說一下關(guān)于種板設(shè)置問題。周圍一圈孔因為邊緣效應(yīng)都是不用來做實驗的。一般每組樣品設(shè)置6個復(fù)孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。用的是排槍，會省很多力氣，但是也會增大組內(nèi)誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個實驗大家遇到的最大問題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實就一個原則，把OD值控制在1.0左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來彌補(bǔ)。還有實驗操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。

補(bǔ)充： 突然想起用酶標(biāo)儀檢測的時候還有一些細(xì)節(jié)問題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補(bǔ)充說明：這幾天有同學(xué)提出了一個問題，這個問題非常好也非常關(guān)鍵：將OD值控制在1.0這個說法是否有依據(jù)？

這里提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過多少試驗反復(fù)驗證。這里推薦大家用ZETA LIFE的CCK8試劑盒，OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說到實驗設(shè)計，酶標(biāo)儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學(xué)會了解利用紫外檢測有一個最佳檢測范圍，超過了這個范圍，數(shù)值就會呈現(xiàn)出不穩(wěn)定，無規(guī)律。（大家可以把自己的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析看看是不是數(shù)值控制在1.0附近更穩(wěn)定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測范圍，儀器讀數(shù)為—。在摸條件的時候，cck8加入2.0h后檢測就出現(xiàn)過酶標(biāo)儀讀不出數(shù)據(jù)的情況。

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