如何運(yùn)用生物化學(xué)方法檢測細(xì)胞凋亡？

本期小編帶來細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)檢測方法。

一、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測方法

原理：在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA的片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。

AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。 

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。 

因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。這里推薦ZETA LIFE的Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，實(shí)驗(yàn)操作中效果相當(dāng)不錯。

檢測方法：1.按照既定程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；2.按照說明書配制所需溶液；3.常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個細(xì)胞，1500rpm離心，棄上清，將細(xì)胞懸浮在400 µl×結(jié)合溶液中；4.將細(xì)胞懸液分成5管，每管約1×106個細(xì)胞，陰性對照管不加任何試劑，陽性對照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標(biāo)記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC標(biāo)記Annexin V，最后一管加10 µl PI和FITC標(biāo)記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘；5.每管各加400 µl 1× 結(jié)合緩沖液上機(jī)檢測。

注意事項(xiàng)：A.確定細(xì)胞凋亡發(fā)生的時間，PS外翻只發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期，建議先觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)后決定取樣檢測時間；B.由于EDTA會絡(luò)合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結(jié)合，因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后可能導(dǎo)致胰酶對細(xì)胞的進(jìn)一步作用從而導(dǎo)致細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡，建議在用胰蛋白酶處理前單獨(dú)收集培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞，保存在2%的BSA中。

二、磷脂酰絲氨酸單抗（PS）檢測法

原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來檢測細(xì)胞凋亡過程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強(qiáng)，信號持續(xù)時間久，費(fèi)用更低。

三、TUNEL法

原理：TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記。

細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。

TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

不足之處：

(1)壞死細(xì)胞亦有DNA裂點(diǎn)形成,也可呈現(xiàn)TUNEL反應(yīng)陽性，因而特異性較差。據(jù)報道，TUNEL反應(yīng)中壞死細(xì)胞的標(biāo)記量比凋亡細(xì)胞的標(biāo)記量少一個數(shù)量級。

(2)TUNEL結(jié)合免疫組化檢測時，固定過程對檢測的影響較大，切片的大小、薄厚會直接影響到固定效果，從而產(chǎn)生結(jié)果的差異。

四、ISOL檢測法

原理：與TUNEL凋亡檢測法類似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段連接）也是通過末端標(biāo)記斷裂DNA的方法。但該方法的創(chuàng)新在于利用ISOL方法，在DNA的片段的平端或3’端單個突出堿基進(jìn)行連接擴(kuò)增，鑒于只有發(fā)生凋亡的細(xì)胞才會發(fā)生平端或3’端單個堿基突出，所以ApopTag 過氧化物酶ISOL凋亡檢測試劑盒能夠明確的區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

優(yōu)勢：原位特異標(biāo)記，能夠最大限度的降低背景，克服TUNEL法檢測的假陽性，適用于石蠟包埋的組織、冰凍組織、貼壁細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞的凋亡檢測。

五、DNA凝膠電泳(DNAladder) 

凋亡過程中DNA裂解是標(biāo)志細(xì)胞最終走向死亡的不可逆的重要過程，DNA凝膠電泳也曾被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡判定的金標(biāo)準(zhǔn)之一。抽提細(xì)胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度，然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正常活細(xì)胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶;細(xì)胞凋亡時，由于DNA被裂解成單個核小體和寡聚核小體，電泳時呈現(xiàn)特征性的“階梯狀"(ladder)條帶，壞死細(xì)胞的DNA是被隨機(jī)破壞的，不能形成階梯狀條帶，電泳時出現(xiàn)類似血涂片的連續(xù)性改變。此方法是判斷細(xì)胞有無凋亡發(fā)生的一種簡便方法，比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細(xì)胞的檢測。

缺點(diǎn)：

(1)特異性較差，特征性的180～200bpDNA梯帶的出現(xiàn)并非凋亡所有，另外在某些罕見的情況下細(xì)胞發(fā)生凋亡可無DNA斷裂；

(2)不能提供單個細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞的組織學(xué)定位或細(xì)胞分化等凋亡信息；

(3)不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量，只能進(jìn)行半定量；

(4)靈敏性較差，要求所測標(biāo)本細(xì)胞數(shù)在1×106以上才能使電泳清晰；

(5)適用于只含有單一細(xì)胞成分標(biāo)本的測定，對組織細(xì)胞組成復(fù)雜者，不能確定凋亡發(fā)生于哪類細(xì)胞。

六、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定

ELISA是定量檢測細(xì)胞凋亡的免疫化學(xué)法，其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測細(xì)胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA的片斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細(xì)胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結(jié)合；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結(jié)合；加酶的底物，測光吸收值。此方法敏感性高，所需細(xì)胞數(shù)少，可檢測低至5×102/mL的凋亡細(xì)胞。此外，此方法不需特殊儀器，比較適合基層工作。

缺點(diǎn)：

(1)不能精確測定凋亡發(fā)生的絕對量；

(2)適合單一成分細(xì)胞的檢測，對于多細(xì)胞成分的組織或細(xì)胞混合物，不能判定凋亡發(fā)生在哪種細(xì)胞；

(3)不能提供單個細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞的組織學(xué)定位。