薄層層析法測定氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶含量實驗

步驟

材料

緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組分請見附錄 1。
貯存液稀釋到適當濃度。

CAT 反應混合物 1
1mol/LTris-Cl(pH7.8)50ul
[14C] 氯霉素 (60mCi/mmol, 用水稀釋到 0.1mCi/ml)10ul
乙酰輔酶 A(新鮮配制，水溶液濃度 3.5 mg/ml)20ul
每測定 50ul 細胞裂解物需要準備 80ulCAT 反應混合物。反應混合物在臨用前配制。
乙酰酶 A 是輔酶 A 的 S-乙?；问健蓚€碘單位以這種形式從脂肪和碳水化合物進入檸檬酸循環(huán)。乙酰輔酶 A 在很多生物反應中作為乙酰基化的輔助因子，如在本方案中，通過 CAT 使氯霉素?；托枰阴］o酶 A 作為輔助因子。

乙基乙酸
乙基乙酸（CH2COOCH2CH3) 是用于 CAT 活性薄層層析測定的有機溶劑。1 份乙基乙酸和 19 份氯仿混合制成的溶劑可以把乙酰基化和非乙?；问降穆让顾卦诠枘z板上分開。乙基乙酸是非常易燃（閃燃點=-4°C) 的揮發(fā)性酯類，有成熟水果的味道。



裂解緩沖液
0.1mol/LTris-Cl（pH7.8)
0.5%(V/V)TritonX-100
通過去污劑裂解細胞時使用（請見步驟 4)。
同樣的裂解緩沖液可制備用于測量β-半乳糖苷酶活性的細胞抽提物（請見方案 7）。
重要：細胞裂解緩沖液需用髙純度的 TritonX-100 制品。低等級的去污劑會抑制 CAT 酶活性。裂解緩沖液中可以用去污劑0.125%(V/V) 的 NonidetP-40 代替 TritonX-100。

不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液（PBS)

薄層層析（TLC) 溶劑
190 ml 氯仿
10 ml 甲醇
毎個 TLC 槽需要準備 200 ml。每個槽可以用兩個 TLC 板。

Tris-Cl(1mol/L,pH7.8)

放射性化合物

放射性墨水
用于作點標記，指示 TCL 柜放射自顯影圖的方向。

特殊設備

干冰/乙醇浴
用于凍融法裂解細胞。

使用不溶于乙醇的墨水的記號筆

旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器
例如 Savant Speed Vac 牌。

橡膠棒

薄層層析板（例如 Sybron SIL G/UV254,Brinkmann 公司）

薄層層析槽（27.5 cm X27.5 cm X7.5 cm)
科學供應品商店提供這類槽（如 Sigma-Aldrich Techware 公司)。

預設為 65°C 的水浴

細胞和組織

用攜帶感興趣 DNA 的 pCAT 載體轉(zhuǎn)染的哺乳動物培養(yǎng)細胞
需要用一個 CAT 報道分子載體（如 pCAT3 系列）和帶有β-半乳糖苷酶基因（pCMV-SPORT-β-gal；請見第 16 章圖 16-2) 或其他適于使 CAT 測量結(jié)果標準化的報進基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染（使用第 16 章中的某種轉(zhuǎn)染方案）細胞。pCAT 系列載體的詳細情況請見圖 17-3。

方法

轉(zhuǎn)染細胞沉淀的制備

1. 從經(jīng)過轉(zhuǎn)染并在 90 mm 組織培養(yǎng)皿中生長的單層細胞輕輕地吸掉培養(yǎng)液。單層細胞用 5 ml 不含鈣鹽和鎂鹽的 PBS 洗 3 次。

2. 把培養(yǎng)皿以某個角度放置 2~3 min，使最后殘留的 PBS 流到一側(cè)。吸掉 PBS 殘液。每個培養(yǎng)皿加 lmlPBS，用橡膠棒把細胞刮到離心管中。冰浴，直到所有的培養(yǎng)皿處理完畢。

3. 室溫下以最大速度離心 10s 收集細胞。用 lml 冰冷的 PBS 輕輕地重懸細胞沉淀，然后再次離心收集細胞。去掉細胞沉淀與管壁中的 PBS 殘液。細胞沉淀可以貯存在-20°C 以作將來分析用，也可以用步驟 4 的某種方法制備細胞抽提物。
用連有真空管的一次性吸頭可以很方便地去除 PBS。吸頭接觸液面，緩緩地吸。當液體下降的時候. 使吸頭盡可能地遠離細胞沉淀，然后用吸頭吸掉沾附在管壁上的液滴。

制備細胞抽提物

4. 裂解細胞是用反復凍融法或用含有去污劑的緩沖液處理細胞。后一種方法快速簡便，而且適用于在 96 孔板上測量 CAT、β-半乳糖苷酶和其他標記基因（方案 6）(Bignon et al.1993)。

反復凍融法裂解細胞

a. 在 90 mm 培養(yǎng)皿中，用 l00ul 0.25mol/L Tris-Cl(pH7.8) 重懸細胞沉淀。劇烈振蕩打散細胞團塊。

b. 細胞在干冰/乙醇浴中凍，在 37°C 融解，并進行 3 個循環(huán)以破壞細胞。確定管子事先用不溶于乙醇的墨水進行過標記。

c. 破碎的細胞在 4°C 以最大速度離心 5 min。上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。取 50ul 上清用于測量 CAT, 余下的抽提物貯存于-20°C。

用含有去污劑的緩沖液裂解細胞

a. 步驟 3 中的細胞沉淀用 500ul 裂解緩沖液重懸?；旌衔镌?37°C 孵育 15 min。
在 35 mm 培養(yǎng)血中生長的細胞抽提時需要用 100ul 裂解緩沖液。

b. 以最大速度離心 10 min 去除細胞碎片?；厥丈蠝[。選用一種本方案所述的方法來測量 CAT 活性。余下清亮的裂解物在液氮中速凍，然后貯存在-70°C。

用薄層層析法測定 CAT 活性

5.50ul 細胞抽提物在 65°C 孵育 10 min 使內(nèi)源性的去乙?；甘Щ睢Ｈ绻@時候抽提物混濁不透明，在 4°C 最大速度離心 2 min 以去除微粒。

6. 每個待測樣品用 80ulCAT 反應混合物 1 混合，37°C 孵育。孵育時間的長短與細胞抽提物中 CAT 的濃度有關，而 CAT 的濃度又與所研究的啟動子強度和細胞類型有關。大多數(shù)情況下，孵育 30 min 到 2 h 就足夠了。
如果轉(zhuǎn)染的細胞中 CAT 基因表達很低，這步反應可以孵育更長的時間（最長至 16 h)。但最在這種情況下，建議毎個反應孵育 2 h 后再補加 10ul 乙酰輔酶 A。

7. 每個樣品加 lml 乙基乙酸，振蕩 3 次，每次 10s, *使溶液混勻。混合物在室溫下以最大速度離心 5 min。
乙酰基化的氯霉素進入到有機相（上層）中；非乙酰基化的氯霉素仍留在水相中。

8. 用移液管把 900ul 有機相轉(zhuǎn)移到新管中，小心避免水相和中間相混入。把含有下層相的管子作為放射性廢物丟棄。

9. 把管子放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（如 Savant SpeedVac 牌), 真空下使乙基乙酸揮發(fā)約 lh。

10. 每個管子加 25ul 乙基乙酸，輕輕振蕩，使反應產(chǎn)物溶解。

11. 把 10~15ul 已溶解的反應產(chǎn)物加到 25 mm 硅膠 TLC 板的起點處。板上的起點用軟石墨鉛筆標記。每次加樣 5ul, 用吹風機把樣品吹干。

12. 準備盛有 200 mlTCL 溶劑的 TCL 槽。把 TCL 板放進槽中，關上容器，然后使溶劑前沿移動到板上端大約 75% 的地方。
可以用許多不同的 TCL 板和指劑來分離乙酰基化的氯霉素。我們通常用氯仿：甲醇 (95:5) 和 Sybron SILG/UV254(Brinkmann 公司）TCL 板。Touchstone(1992) 對 TCL 方法及其疑難問題作了很好的介紹和說明。

13. 把 TCL 板從槽中取出來，在室溫下干燥。用放射性墨水在 TCL 板上作點標記以便于對齊板與膠片的位置，然后用板對 X 射線膠片曝光?；蛘甙寻宸旁诹灼练治龅暮凶永铩：凶釉谑覝叵路胖眠m當?shù)臅r間。
TCL 板上不要蓋 Satan 膜，因為蓋上膜之后會隔斷 14C 同位素發(fā)出的較弱的放射線。

14. 沖洗 X 射線膠片并與 TCL 板校對位置。此外，還可以用層析圖對磷屏分析設備的圖像板曝光或把 TCL 板拿去掃描。
通?？煽吹饺齻€放射性斑點。從起點遷移距離最近的點是進入乙基乙酸的非乙?；穆让顾?。另兩個遷移得稍快的斑點是兩個潛在的可酰基化位置中的某一個被乙酰基化的氯霉素。只有當使用了高濃度 CAT 或用大量抽提蛋白進行長時間的孵育后，才能看到遷移得更快的第三種斑點，它是雙乙?；穆让顾亍?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; color: rgb(77, 88, 101) !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>
15. 為了對 CAT 活性定量，需要從 TCL 板中把放射性斑點切下來，然后用液閃計數(shù)器測定放射性量（請見附錄 9）。取另一份細胞抽提物（來自前面的步驟 3)，用 Bradford 分析法等快速比色法確定抽提物中的蛋白濃度。測定蛋白濃度前，把 Triton X-100 的濃度稀釋為≤0.1%, 以免發(fā)生交叉反應。CAT 活性表示為每單位時間每毫克細胞抽提物蛋白中產(chǎn)生乙?；a(chǎn)物的皮摩爾數(shù)。
當處理大量樣品時，先硅膠薄層度析，接著切膠和對修飾過的氯霉素產(chǎn)物進行閃爍計數(shù)的方法會變得非常膩味，這些情況下進行產(chǎn)物定量的另一種方法是用磷屏設備對 TCL 板進行掃描。
在不含細胞抽提物的情況下仍然「固有」的氯霉素己?；赡軙纬杀尘?。如果這會有問題，試著把實驗中氯霉素的濃度降低 2-4 倍（Heard et al.1987)。