測(cè)定用乙醇固定的 DNA 的含量

材料與儀器

細(xì)胞樣品
PBS緩沖液 70%乙醇 PI液
離心機(jī) 恒溫箱 篩網(wǎng)

步驟

一、培養(yǎng)細(xì)胞的 DNA 含量的測(cè)定

制備單細(xì)胞懸液于 200μ l 的 PBS 緩沖液中； 加入 2ml 預(yù)冷的 70%乙醇，4℃保存；

1. 取單細(xì)胞懸液 1——2×106 個(gè)細(xì)胞于 PBS（PH=7.2）緩沖液中；

2. 300g 離心 5 分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；

3. 重懸細(xì)胞于 0.5ml PBS 緩沖液中；

4. 將細(xì)胞懸液放置于 2——3ml 冷 70%乙醇中，混勻，保存于4℃，至少30 分鐘。 在 4℃條件下可保存 2——3 周。

2、新鮮組織的 DNA 含量的測(cè)定

1. 用 200mg 濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液；

2. 500g 離心 5 分鐘；

3. 棄上清，重懸于 10ml 染色- 去污劑中；

4. 再過(guò)濾，用 200 目的篩網(wǎng)或 70——80μm 的篩網(wǎng)過(guò)濾；

5. 上機(jī)檢測(cè)。

3、石蠟包埋組織切片的 DNA 含量的測(cè)定

1. 從石蠟包埋切取切片 50 μ m 厚，2——3 片，制成單細(xì)胞懸液；

2. 用 PBS 緩沖液洗滌，500g 離心 5 分鐘，棄上清；

3. 加入 PI 液 1ml 室溫避光 30 分鐘；

4. 調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/ml；

5. 上機(jī)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，固定劑也可選用 1——3%多聚甲醛;

2. 將乙醇作為固定劑時(shí)，乙醇應(yīng)預(yù)冷至 0——4℃;

3. 細(xì)胞在固定時(shí)，固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增 加，并不斷震搖，以免細(xì)胞成團(tuán)（特別是用乙醇固定時(shí)） .

常見(jiàn)問(wèn)題

如果想要檢測(cè)樣品的純度,那么還要再測(cè)一次280nm處OD值,計(jì)算二者的比率,若比率接近2，說(shuō)明樣品純度較高。