ELISA實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)及常見問題解答

一、ELISA操作前準(zhǔn)備工作

試劑盒的選擇

ELISA操作前，應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作。

樣本處理

在收集標(biāo)本前需有一個(gè)完整的計(jì)劃，需要清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測，對(duì)收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的標(biāo)本，及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集?biāo)本，請(qǐng)取材后，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。

二、ELISA標(biāo)準(zhǔn)品溶解

標(biāo)準(zhǔn)品是試劑盒的檢測抗原的一個(gè)度量標(biāo)尺，因此標(biāo)準(zhǔn)品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細(xì)節(jié)：凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解按照說明書的要求，準(zhǔn)確復(fù)溶。在冰上操作標(biāo)準(zhǔn)品為佳，靜止5－10分鐘，輕輕搖勻后按照一次量分裝，在-20度或-70度保存。標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)禁反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準(zhǔn)備，如離心管的準(zhǔn)備和編號(hào)以及稀釋液的準(zhǔn)備；稀釋時(shí)，應(yīng)充分混勻；采用進(jìn)口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，注意操作規(guī)范，槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。

三、ELISA操作中的洗滌

洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中是最多次數(shù)的操作，也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果差的現(xiàn)象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機(jī)，嚴(yán)格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實(shí)驗(yàn)誤差和不同實(shí)驗(yàn)之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象，請(qǐng)比照“手工洗板小貼士"操作：

a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會(huì)增高。

b)特別注意：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要考慮實(shí)驗(yàn)孔的位置，保證甩掉洗液時(shí)，空白孔、低濃度孔或陰性對(duì)照組在上面或一側(cè)或分開最好。同時(shí)注意甩掉洗液的動(dòng)作翻轉(zhuǎn)（從正上方旋轉(zhuǎn)120－150度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體！甩出后以直線方式補(bǔ)2－3次甩出液體。 

c)用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙，因?yàn)榧?xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導(dǎo)致洗板不干凈，結(jié)果偏高或偏低，重復(fù)孔的數(shù)值也會(huì)相差很大。

d)每次拍板不要重復(fù)在一個(gè)地方拍，特別是洗去酶的步驟；拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會(huì)對(duì)蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要扣干凈。

e)不能減少洗液體積、洗板時(shí)間和次數(shù)。洗板時(shí)間太短，洗板效果不佳。延長洗板時(shí)間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。

四、ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如何擬合？

一般情況按照說明書推薦方法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以由酶標(biāo)儀附帶軟件自動(dòng)生成，也可手動(dòng)制作。標(biāo)準(zhǔn)曲線呈“S"形曲線，兩端趨于水平，中間趨于線性，中間部分為較佳的檢測范圍。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的量超過與包被抗體結(jié)合的量，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品已飽和，再增加標(biāo)準(zhǔn)品的量，其OD值不再變化，故當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到一定濃度后，曲線就趨于水平。一般廠商給出的濃度范圍落在中間線性范圍，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測出樣本的濃度。按照科學(xué)分析方法，如果存在“奇異點(diǎn)"或者“污點(diǎn)"，直接采用線性分析不是很好，要對(duì)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的幾個(gè)點(diǎn)進(jìn)行取舍，同時(shí)也可改用雙對(duì)數(shù)直線擬合或者四因素曲線擬合。

五、常見問題

1、ELISA試驗(yàn)出現(xiàn)非常弱的結(jié)果，常見有7種原因，其解決方法如下：

1)可能原因：溫育的時(shí)間或者溫度不夠；

解決方法：校正溫育箱溫度。

2)可能原因：顯色反應(yīng)時(shí)間太短；

解決方法：校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)。

3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題；

解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。

4)可能原因：加入抗體/酶的稀釋液濃度太低；

解決方法：按照說明書保存試劑盒和準(zhǔn)確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密。

5)可能原因：酶標(biāo)儀濾光片不正確；

解決方法：檢查酶標(biāo)儀使用的濾光片。

6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡；

解決方法：試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。

7)可能原因：不正確的試劑儲(chǔ)存方式；

解決方法：按照說明書要求保存試劑盒。

2、試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定的重復(fù)性差，這是什么原因造成的？

答：試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定的重復(fù)性差，這是典型的由測定操作引起的問題，常見原因如下：

a)可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；

解決方法：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密。

重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近；

重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；

樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

b)可能原因：加樣過快，孔間發(fā)生污染；

解決方法：重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快。         

c)可能原因：加錯(cuò)樣本；

解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯(cuò)樣本。

d)可能原因：加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；

解決方法：加樣槍頭不要貼壁。

e)可能原因：不同批號(hào)試劑盒中組分混用；

解決方法：不同批號(hào)試劑盒中組分不可混用。

f)可能原因：溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；

解決方法：檢查時(shí)間是否一致。

g)可能原因：孔內(nèi)污染雜物；

解決方法：離心樣品，排除雜物。

h)可能原因：試劑/樣品沒有混勻；

解決方法：充分混勻樣品和試劑。

i)可能原因：血清標(biāo)本未*凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血    

細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)等。

解決方法：待血清標(biāo)本*凝固后做試驗(yàn)。

3、 試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽性對(duì)照不顯色，應(yīng)如何分析和查找原因？

答：試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽性對(duì)照不顯色，常見原因如下：

a)可能原因：漏加或者誤加試劑；

解決方法：檢查試驗(yàn)記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對(duì)標(biāo)簽。

b)可能原因：試劑過期；

解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品。

c)可能原因：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物（疊氮鈉 

等）；

解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。

d)可能原因：溫育的時(shí)間或溫度不夠；

解決方法：校正溫育箱溫度。

e)可能原因：標(biāo)準(zhǔn)品失活或者丟失；

解決方法：標(biāo)準(zhǔn)品正確保存、溶解和混勻。

f)可能原因：抗體失活或者丟失；

解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度

g)可能原因：酶失活或者丟失

檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達(dá)到1.0左右，此為酶的粗略估計(jì)。

解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。  

h)可能原因：顯色底物失活

檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。

解決辦法：更換顯色底物.

4. 試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，這是什么原因造成的？

答：試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，常見原因如下：

a)可能原因：洗板不干凈；

解決方法：充分洗滌，*拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準(zhǔn)確配制；吸嘴盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。

b)可能原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過期；

解決方法：檢查試劑盒有效期。

c)可能原因：試劑稀釋有誤，如加酶的濃度過高；

解決方法：請(qǐng)按說明書所示稀釋倍數(shù)配制；

d)可能原因：蒸餾水受酶等污染；

解決方法：使用新鮮蒸餾水；

e)可能原因：試劑混用；

解決方法：不同批號(hào)試劑勿混用。

f)可能原因：培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長。

解決方法：顯色反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)縮短。

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