免疫組化IHC實驗經(jīng)驗總結(jié)

1、免疫組化實驗所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？

實驗所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最為常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中最佳的組織標(biāo)本制作方法。

2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？

石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時，需要*行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

3、免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最為常用。

4、石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度； 

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 

4）用高溫修復(fù)時，溫度驟冷也可能引起。 

5、邊緣效應(yīng)

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

6、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條； 

2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看； 

3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 

4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果； 

5）DAB孵育時間過長或濃度過高； 

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 

7）標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。

7、免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤；   

2）抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)； 

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時間過長；

5）DAB孵育時間過短；

6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

8、背景

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?/p>

2）然后調(diào)整DAB孵育時間；

3）也要考慮血清封閉時間是否過短；

4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。

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