原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

原代細(xì)胞在相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用過程中越來越多，人們不再單單趨于使用細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，因?yàn)榧?xì)胞系常常由于體外長期培養(yǎng)，而容易丟失原有的生物學(xué)特性，對藥物處理的反應(yīng)差距越來越大。

原代細(xì)胞剛從組織中分離開，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也*為接近和反應(yīng)體內(nèi)生長特性，原代細(xì)胞的活力和生長狀態(tài)都比較好，細(xì)胞的純度和基因保留可達(dá)到90%以上，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等試驗(yàn)研究，使用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以獲得更準(zhǔn)確的研究和數(shù)據(jù)。

角質(zhì)形成細(xì)胞是一種不斷分化的復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞，其分化的最終階是形成角蛋白。根據(jù)角質(zhì)形成細(xì)胞的發(fā)展階段和特點(diǎn)，從內(nèi)向外可將其分為五層?；准?xì)胞層又稱生發(fā)層，棘細(xì)胞層，顆粒層，透明層，角質(zhì)層。

角質(zhì)形成細(xì)胞的分化成熟表現(xiàn)為從基底層到向角質(zhì)層的逐漸移行。在單一移行過程中，角質(zhì)形成;細(xì)胞的形狀和功能也逐漸發(fā)生著變化，從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細(xì)胞核消失的角質(zhì)層。

新生的基底細(xì)胞進(jìn)入棘細(xì)胞層，然后上移到顆粒層的最上層。細(xì)胞組織來源于實(shí)驗(yàn)動物的正常皮膚組織，細(xì)胞生長狀態(tài)為貼壁培養(yǎng)。

1.培養(yǎng)基1：iCell原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系

4.基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12

5.緩沖液：無菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.4

6.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ

7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA

8.消化液3：0.1%Ⅰ型膠原酶

9.75%醫(yī)用酒精

10.胎牛血清（FBS）

1.培養(yǎng)皿

2.T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

3.100目不銹鋼網(wǎng)篩

4.200目不銹鋼網(wǎng)篩

5.眼科剪

6.眼科鑷

7.離心管（15ml、50ml）

1.新鮮的包皮組織，裝盛于含有無菌生理鹽水或1×PBS的無菌容器中，于保溫盒中，冰上放置離體6h內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分離。

2.在無菌環(huán)境中取出包皮組織，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s

3.酒精浸泡組織后快速將組織轉(zhuǎn)入裝有1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗數(shù)次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下組織（脂肪，微血管等）

4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1  4度消化過夜（15-18h）。

5.第二天，用2個眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織，分離真皮和表皮；

6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。

7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，過200目不銹鋼網(wǎng)篩后取濾懸液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，400g離心10分鐘，離心完成后棄去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后，400g離心5min離心完成后棄去上清，沉淀用2ml的原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸后，轉(zhuǎn)入已經(jīng)裝有2ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

8.視細(xì)胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細(xì)胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)，視細(xì)胞生長狀況和培養(yǎng)基顏色每2-3d換液一次；待細(xì)胞貼壁率達(dá)到80-90%后，進(jìn)行常規(guī)傳代擴(kuò)增操作（角質(zhì)細(xì)胞對胰酶不太敏感，消化時間可能會增加到10-15分鐘，有時需要配合使用無菌細(xì)胞刮鏟進(jìn)行傳代）。