血管形成實(shí)驗(yàn)容易出現(xiàn)的BUG

      血管生長(zhǎng)是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。通過(guò)抑制腫瘤血管生成來(lái)阻止腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移合乎邏輯。

      血管生成(angiogenesis)是生殖、生長(zhǎng)發(fā)育和修復(fù)的基礎(chǔ)。腫瘤無(wú)新生血管時(shí),直徑很少超過(guò)2 mm-3 mm,其生長(zhǎng)處于休眠狀態(tài)。當(dāng)腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶長(zhǎng)大到一定程度,氧及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的排出就出現(xiàn)不足。一旦血管長(zhǎng)入腫瘤,供給腫瘤組織營(yíng)養(yǎng)和氧的方式由周邊彌散變成血液灌注,其代謝產(chǎn)物也能在血液循環(huán)時(shí)徹-底清除。腫瘤血管不僅為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)和氧,運(yùn)走代謝產(chǎn)物,還決定腫瘤的病理生理、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和對(duì)各種治療的反應(yīng) 。該觀點(diǎn)于1971年經(jīng)Folkman梳理,加之隨后血管生長(zhǎng)因子被發(fā)現(xiàn),這個(gè)問(wèn)題受到學(xué)術(shù)界極大重視,相關(guān)藥物研究也隨之蓬勃發(fā)展。

      腫瘤血管生成包括了以下五種方式 。血管生成 (angiogenesis)即腫瘤組織在原有微血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上通 過(guò)“芽生"方式形成新血管;血管發(fā)生(vasculogenesis) 即血液或骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞形成新血管;血管套疊 (intussusception)即間質(zhì)組織摻入到已有的血管參與腫瘤血管的構(gòu)成;馬賽克血管(mosaic vessel)即內(nèi)皮細(xì)胞和分散的腫瘤細(xì)胞本身相間排列組成血管;血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry)即腫瘤細(xì)胞模擬并取代內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)。 

      體外的血管形成實(shí)驗(yàn)成為研究的熱點(diǎn)，目前血管形成實(shí)驗(yàn)一般都采用內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合條件培養(yǎng)基或結(jié)合腫瘤細(xì)胞并接種于基底上就形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，觀察其形成的結(jié)構(gòu)，之后通過(guò)各種軟件進(jìn)行定量分析。目前做的比較多的是內(nèi)皮的小管形成：

1. 內(nèi)皮的代數(shù)不能太多，若是HUVEC ，HMEC-1等細(xì)胞系去做此類的實(shí)驗(yàn)，建議細(xì)胞的代次控制在7代內(nèi)，若細(xì)胞形態(tài)不好，與鋪板成管的關(guān)系會(huì)很大，所以在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要在細(xì)胞具有最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，最佳形態(tài)，并且無(wú)任何污染的情況下鋪板，細(xì)胞盡量鋪勻，要不然做出來(lái)的小管可能會(huì)存在斷點(diǎn)。

2. 原代內(nèi)皮細(xì)胞做小管實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞分離并不是想象中的剝下來(lái)就是內(nèi)皮的那么簡(jiǎn)單，比如Cell Systems的原代細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)就有很具體的說(shuō)明，細(xì)胞在P0的時(shí)候，基本是有雜質(zhì)的，然后需要進(jìn)行磁珠篩選或者酶消化一次，（cell systems的細(xì)胞為了讓科研用戶的實(shí)驗(yàn)更不受抗體影響，一般不采用抗體篩選，這樣原代細(xì)胞在純化之后不會(huì)帶任何抗性，影響實(shí)驗(yàn)最終的結(jié)果）所以原代的內(nèi)皮在做小管實(shí)驗(yàn)的時(shí)候盡量控制傳代的次數(shù)，最好做一個(gè)傳代的極限測(cè)試，然后再根據(jù)結(jié)果復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3. 鋪板基質(zhì)膠的時(shí)候一定要注意：感覺(jué)這個(gè)玩意一定要好的品牌，好的品牌還挺貴的，所以不能浪費(fèi)，鋪膠前可以用無(wú)血清的培養(yǎng)基先稀釋，一般是1：2左右；（建議不稀釋用的心痛，稀釋太大怕成不了管的心理的同學(xué)可以嘗試一下）膠一個(gè)96 孔板一般是50ul左右，土豪可以試試24孔板鋪膠，相比下來(lái)面積更大，拍照的地兒也多，可以各種POSE擺起來(lái)，大佬可以試試血管生成的培養(yǎng)皿，這玩意簡(jiǎn)單省事，直接把細(xì)胞往上一蓋，坐等美圖自動(dòng)生成。

需要注意的點(diǎn)：配制試劑時(shí)，不要產(chǎn)生氣泡；加細(xì)胞懸液時(shí)，不要讓槍頭觸碰基質(zhì)膠，

4. 鋪細(xì)胞的密度要控制好，狀態(tài)和密度息息相關(guān)，若當(dāng)心細(xì)胞不成管可以給它來(lái)點(diǎn)生長(zhǎng)因子如EGF,VEGF等。

5. 拍照的時(shí)間一定要掌握好，千萬(wàn)不能睡過(guò)頭，一般內(nèi)皮細(xì)胞在鋪板后12小時(shí)開始成管，24小時(shí)后開始崩解；

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