小鼠MSC細(xì)胞的提取操作

      MMSC細(xì)胞一般采用，長骨解剖和骨髓分離程序，總體目標(biāo)是快速、系統(tǒng)地取出長骨，并收集骨髓細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。這種方法有助于回答有關(guān)骨髓生物學(xué)、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫學(xué)的關(guān)鍵問題。這項(xiàng)技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是解剖過程快速、標(biāo)準(zhǔn)化，骨髓分離程序相當(dāng)無菌，首先處死小鼠并將小鼠置于仰臥位。

      然后將小鼠的四個(gè)爪墊固定在踝關(guān)節(jié)下方，用70%乙醇噴灑小鼠，徹-底沖洗腿部。下一步，在臀部正上方的下腹部中線右側(cè)做一個(gè)小切口，將切口向下延伸到腿部，穿過踝關(guān)節(jié)。拉回皮膚。

      然后切開固定在股骨近端的股四頭肌，露出大腿骨的前側(cè)，并用銷釘將肌肉從腿部固定出來，與木板成45度角。用剪刀抵住股骨后側(cè)，從膝關(guān)節(jié)上剪下腘繩肌。然后將固定在股骨近端的皮膚和腘繩肌向后拉，露出骨的后側(cè)，并將腘繩肌從腿部固定出來，使固定銷成45度角。

      用鑷子抓住股骨遠(yuǎn)端，剛好在膝關(guān)節(jié)上方。然后引導(dǎo)股骨干兩側(cè)的剪刀刀片朝向髖關(guān)節(jié)。到達(dá)股骨頭后，扭轉(zhuǎn)剪刀，將頂部刀片直接移到股骨頭上方，使股骨脫臼。

     用鑷子抓住股骨干的頂部，從股骨頭上切下軟組織，將股骨從髖臼中取出。然后將整個(gè)腿骨，包括股骨、膝蓋和脛骨向上拉離身體，小心地切斷連接腿部與皮膚的結(jié)締組織和肌肉。當(dāng)所有的結(jié)締組織都被移除后，拉伸踝關(guān)節(jié)并扭轉(zhuǎn)剪刀，使脛骨脫臼。

      抓住脛骨遠(yuǎn)端，注意不要切斷肌腱，將脛骨向上拉離身體和釘板。然后去除任何殘留在膝蓋長骨上的結(jié)締組織，以及任何附加在股骨和脛骨上的肌肉或結(jié)締組織。抓住股骨，使髕骨朝外，股骨頭朝下。

      過度伸展膝關(guān)節(jié)，扭動(dòng)剪刀，使脛骨與股骨脫臼。然后移除所有連接股骨和脛骨的結(jié)締組織。下一步，抓住股骨，使前側(cè)朝外，股骨頭朝下，然后將剪刀沿股骨干向上引導(dǎo)至髁部。

      輕輕地來回旋轉(zhuǎn)剪刀，去除髁突、髕骨和骨骺，露出干骺端。然后，用鑷子、剪刀和低塵擦拭紙去除任何附加在股骨上的肌肉或結(jié)締組織。下一步，抓住脛骨，前側(cè)朝外，踝端朝下。

      如果脛骨骨骺完好無損，將剪刀沿脛骨軸向上引至髁突處，輕輕來回轉(zhuǎn)動(dòng)剪刀，將髁突和骨骺切除，露出脛骨干骺端。然后移除任何附加在脛骨上的肌肉或結(jié)締組織，如剛才所示。為了獲取骨髓，首先用一根18號(hào)的針穿過一根0.5毫升的微量離心管的底部。

     然后把長骨放進(jìn)管子里，膝蓋朝下，蓋上蓋子。將0.5毫升的微型離心管放入1.5毫升的微型離心管中，并在大于或等于10000倍g的微型離心管中離心15秒。通過目視檢查確認(rèn)骨髓已經(jīng)從骨頭中旋出。

•使用10mL注射器，抽出骨髓細(xì)胞

•轉(zhuǎn)移至50mL錐形管中，用FSB將體積增加至50mL

•將50uL樣品轉(zhuǎn)移到eppendorf試管中，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

•以1200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)細(xì)胞8分鐘

•從離心細(xì)胞中倒出上清液，轉(zhuǎn)入干細(xì)胞完-全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)

       正常培養(yǎng)第一天                    正常培養(yǎng)第三天

提取的小鼠的MMSC-bm             

間充質(zhì)干細(xì)胞完-全培養(yǎng)基進(jìn)行純化和培養(yǎng)。

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