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    新生大鼠心臟細(xì)胞的分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間: 2023-04-07  點(diǎn)擊次數(shù): 945次

    材料與儀器

    Sprague Dawley 幼鼠
    胰酶液 乙醇
    攪拌臺(tái) 燒杯

    步驟

    組織消化和分離細(xì)胞

    1. 在細(xì)胞操作間內(nèi),放一個(gè)加熱攪拌臺(tái),上放一個(gè)裝有 100 ml 滅菌水的容量 600 ml 的燒杯,加熱至 37℃。

    2. 準(zhǔn)備胰酶液。用水浴或溫箱使胰酶液溫度保持在 37℃。

    3. 做一個(gè)冰臺(tái):將一只平皿裝滿冰后倒置即可,70% 乙醇擦拭平皿后放進(jìn)操作臺(tái)。取 3 個(gè) 60 mm 的一次性組織培養(yǎng)用平皿,加入 5 ml 鹽水 A,標(biāo)記上 1,2,3 放進(jìn)操作臺(tái)的冰臺(tái)上。

    4. 取一只干凈加蓋的燒杯,內(nèi)放一塊 Metofane 飽和的紗布,把 0~1 日齡的 Sprague Dawley 幼鼠放進(jìn)該燒杯中麻醉。20 只 幼鼠大約需要 5 分鐘時(shí)間。用 70% 乙醇擦凈燒杯再放進(jìn)操作間。

    5. 一次取出一只幼鼠,一定要再蓋好蓋子,然后將幼鼠躺著放在一塊無(wú)菌紗布上,用乙醇擦洗其胸部及腹部。把鼠肩胛骨往后夾,使突出胸腔,在肋骨下沿胸骨方向拉一口,摘出心臟放進(jìn)標(biāo)記著 1 的培養(yǎng)皿中。

    6. 繼續(xù)處理余下的幼鼠,一定要保持手套及所用器械潔凈,每次解剖約需 1 分鐘。

    7. 上述操作完成后,用兩把 5 號(hào)鉗子剔除心臟上結(jié)締組織和血-塊再轉(zhuǎn)入標(biāo)記為 2 的培養(yǎng)皿中。再洗一遍,轉(zhuǎn)入標(biāo)記為 3 平皿中。

    8. 取一只無(wú)菌巴斯德吸管輕輕把平皿 3 中的鹽水液 A 吸出,然后加入 2 ml 孵育過(guò)的胰酶液。用準(zhǔn)備好的第二把無(wú)菌解剖刀把心臟切碎成沙粒大小。

    9. 把上述切碎的心臟及胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中。另外吸取 3 ml 新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶,補(bǔ)加胰酶至終體積 10 ml,加上塞子,放入 37℃ 水浴中。打開(kāi)攪拌器,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 r/min 左右,消化 15 分鐘。

    10. 從水浴中拿出錐形瓶,小心吸去上清,上清中的主要成分是血紅細(xì)胞,加入 10 ml 新的胰酶,37℃ 水浴再作用 15 分鐘。

    11. 棄上清。加入 10 ml 新的胰酶,用一支一次性帶刻度的吸管吹打溶液兩次,機(jī)械分散細(xì)胞,再孵育 10 分鐘。

    12. 上述消化處理的同時(shí),往一支 50 ml 的一次性無(wú)菌錐形管中加入 10 ml 冷的接種培養(yǎng)基。

    培養(yǎng)已分離出的細(xì)胞

    13. 消化處理之后,小心移出上清至上述加有接種培養(yǎng)基的錐形管中,這就是第一次收集到的分離出的細(xì)胞。余下的組織塊中加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。

    14. 消化的同時(shí),上述含培養(yǎng)基和細(xì)胞上清的錐形管以 1200 r/min 離心 4 分鐘。輕輕吸去上清,加 5 ml 接種培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞團(tuán)。

    15. 重復(fù) 11~14 步驟 9 次,或直至只剩余少許組織塊為止。將所用細(xì)胞懸液集中于一支錐形管中。

    16. 最后一次沉淀細(xì)胞,加接種培養(yǎng)基至 10 ml,吹打幾次以散開(kāi)所有細(xì)胞團(tuán)。

    17. 將上述 10 ml 懸液轉(zhuǎn)移到 100 mm 規(guī)格的無(wú)菌組織培養(yǎng)平皿中,于 5% CO2,高濕度的 37℃ 溫箱中放置 1~1.5 小時(shí),目的是減少成纖維細(xì)胞的污染。

    18. 孵育后,收集所有平皿中的培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中包含非貼壁細(xì)胞,每個(gè)平皿用 10 ml 預(yù)溫的接種培養(yǎng)液沖刷后收集。量一量最后收集溶液的體積,用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞。一般地,總細(xì)胞數(shù)在 5X107~1X108 間,成活率約 85%。

    19. 用接種培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至 5X105~6X105 細(xì)胞/ml,制成接種液。

    20. 每只 35 mm 規(guī)格平皿加 2 ml 上述接種液,60 mm 規(guī)格的平皿加 5 ml 的接種液,孵育 4~6 小時(shí)。

    21. 4~6 小時(shí)后,用培養(yǎng)基或鹽水液 A 輕輕洗涮平皿兩次,倒掉,加入交換培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過(guò)夜。

    22. 用培養(yǎng)基或鹽水 A 沖洗平皿兩次,加入新配制的交換培養(yǎng)基,繼續(xù)溫育,兩天換一次液。


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