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    標(biāo)記抗體的應(yīng)用技術(shù)

    發(fā)布時(shí)間： 2023-04-12　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1122次

    原理

    ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
    　

    材料與儀器

    BSA 血清
    碳酸鹽緩沖液 PBS 蒸餾水 磷酸棗檸檬酸 四甲基聯(lián)苯胺
    塑料板 ELISA檢測(cè)儀 加樣器 滴頭 毛巾 洗滌瓶 燒杯 玻璃棒 試管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱

    步驟

    一、用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法

    1. 包被

    用0.05 M PH9 牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 ml，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。

    2. 加樣

    加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）。
    　　
    3. 加酶標(biāo)抗體

    于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 小時(shí)，洗滌。
    　　
    4. 加底物液顯色

    于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml，37 ℃10～30 分鐘。
    　　
    5. 終止反應(yīng)

    于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 ml。
    　
    6. 結(jié)果判定

    （1）可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果。

    反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號(hào)表示。

    （2）可測(cè)OD值

    在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm（若以ABTS顯色，則410 nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

    二、用于檢測(cè)未知抗體的間接法

    1. 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/ml，每孔加0.1 ml，4 ℃過夜。次日洗滌3 次。
    　　　　　　　　　　　　　　
    2. 加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1小時(shí)，洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照）
    　　　　　　　　　　　　　　
    3. 于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗體）0.1 ml，37 ℃孵育30-60 分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌。
    　　　　　　　　　　　
    4. 其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。
    　　

    注意事項(xiàng)

    1. 正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
    　　
    2. 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括
    　　
    （1）固相載體的選擇

    許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
    　　
    （2）包被抗體（或抗原）的選擇

    將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 ℃18～24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10 μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10 μg/ml。
    　　
    （3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇

    首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法“（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
    　　
    （4）酶的底物及供氫體的選擇

    對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。


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