蛋白酶活性檢測方法

1 定義

1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和PH值條件下，1min水解酪素產生1ug酪氨酸為一個酶活力單位，以(u/ mL)表示。

2 福林法(第一法)

2、1 原理

蛋白酶在一琿的溫度與PH條件下，水解底物，產生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍與鎢藍，用分光度法測定，計算其酶活力。

2、2 試劑和溶液

2、2、1 福林試劑的制備

于2000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2Wo4·2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL，水火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風櫥中加入硫酸鋰(Li2SO4)50g、水50mL和數(shù)滴濃溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有綠色需再加溴水，再煮沸除去過量的溴)，冷卻，見水定溶至1000ml?；靹?，過濾。制得的試劑應呈金黃色，貯存于棕色瓶內。

使用溶液：一份福林試劑與二份水混合，搖勻。

2、2、2 碳酸鈉溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L

稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三錄乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L

稱取三錄乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氫氧化鈉溶液c(NaOH)=0.5mol/L

按GB601配制。

2、2、5 鹽酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L

按GB601配制。

2、2、6 緩沖溶液

a、磷酸緩沖液 (PH=7.5)適用于中性蛋白酶

稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸緩沖液(PH=3.0)適用于酸性蛋白酶

甲液 稱取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液 稱取乳酸鈉(70%)16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05moi/L乳酸緩沖溶液。

c、硼酸緩沖溶液(PH=10.5)適用于堿性蛋白酶

甲液 稱取硼酸鈉(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液 稱取氫氧化鈉4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混勻，用水稀釋至1000mL。

上述各種緩沖溶液，均須用PH計校正。

2、2、7 10g/L酪素3)溶液

稱取酪素1.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液(若酸性蛋白酶則用濃乳酸2～3滴)濕潤后，加入適量的各種適宜PH的緩沖溶液約80 mL，在沸水浴中

邊加熱邊攪拌，直到全部溶解，冷卻后，轉入100 mL容量瓶中，用適宜的PH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內貯存，有效期為三天。

注：3)酪素采用上?；瘜W試劑采購供應站經(jīng)銷的試劑。

2、2、8 100ug/mL L-酪氨酸4)標準溶液

a、稱取預先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，用1mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1mg/ mL酪氨酸標準溶液。

注：4)L-酪氨酸采用上海長江生化制藥廠產品。

b、吸取1mg/ mL酪氨酸標準溶液10.00 mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L-酪氨酸標準溶液。

2、3 儀器和設備

2、3、1 恒溫水浴 40±0.2℃。

2、3、2 分光光度計 應符合GB9721的規(guī)定。

2、4 分析步驟

2、4、1 標準曲線的繪制

a、L-酪氨酸標準溶液

按表3配制

表3 

     、b、分別取上述溶液各1.00 mL(須做平等試驗)，各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL、福林試劑使用溶液1.00 mL，置于40±0.2℃水浴中顯色20min，取出，用分光光度計于波長680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度c為橫坐標，繪制標準曲線(此線應通過零點)。

根據(jù)作圖或用回歸方程，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量(ug)，即為吸光常數(shù)K值。其K值應在95～100范圍內。

2、4、2 測定

待測酶液的制備

a、稱取酶粉1～2g，精確至0.0002g(或吸取液體酶1.00 mL)，用少量該酶的緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，然后將上清液小心傾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述緩沖如此溶解、搗研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，搖勻。用四層紗布過濾，濾液根據(jù)酶活力再一次用緩沖液稀釋至適當濃度，供測試用(稀釋至被測試液吸光值在0.25～0.40范圍內)。

b、酶粉測定時，稀釋倍數(shù)參考表A4(液體酶亦可參照表A4稀釋)。

表A4

測定

a、先將酷素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預熱5min;

b、按下列程序操作：

試管A(空白) 試管B(酶試樣，需作三個平行試樣)

加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL

40±0.2℃，2min

加三錄乙酸2.00 mL(搖勻) 加酪素1.00mL(搖勻)

40±0.2℃，10min 40±0.2℃，10min

加酪素1.00(搖勻) 加三錄乙酸2.00mL(搖勻)

取出靜止10min，過濾 取出靜止10min，過濾

取1.00mL濾液 取1.00mL濾液

加碳酸鈉溶液5.0mL 加碳酸鈉溶液5.0mL

加福林試劑使用液1.00mL 加福林試劑使用液1.00mL

40±0.2℃ 顯色20min 40±0.2℃ 顯色20min

于680nm波長，用10mm比色皿 于680nm波長，用10mm比色皿

測其吸光度 測其吸光度

c、1.398和166蛋白酶，除反應與顯色溫度為30±0.2℃外，其它操作同 4、2(2)。標準曲線作同樣處理。

5 計算

X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n…………………(A3)

式中：X——樣品的酶活力，u/g(u/mL);

A——樣品平行試驗的平均吸光度;

K——吸光常數(shù);

4——反應試劑的總體積，mL;

10——反應時間10min，以1min計;

n——稀釋倍數(shù)。

所得結果表示至整數(shù)。

6 結果的允許差

平行試驗相對誤差不得超過3%。

紫外分光光度法(第二法)

1 原理

蛋白酶在一定的溫度與PH條件下，水解酪素底物，然后加入三錄乙酸終止酶反應，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測定。根據(jù)吸光度計算其酶活力。

2 試劑和溶液

同 2。

3 儀器和設備

3、1 恒溫水浴40±0.2℃。

3、2 紫外分光光度計 應符合GB 9721的規(guī)定。

4 分析步驟

4、1 求K值

按第一法( 4、1a)的表A3配制不同濃度的L-酪氨酸標準溶液，然后，直接用紫外分光光度計測定其吸光度(A)，并計算K值(其K值應在130～135)范圍內)。

4、2 待測酶液的制備

a、稱取酶粉1～2g，精確至0.0002g(或吸取酶液1.00 mL),以下操作同A2`4`2中(1)a;

b、測定酶粉時稀釋倍數(shù)參考表A5(液體酶亦可參照表A5稀釋)。

表A5

、4、3 測定

除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三錄乙酸吸取4.00 mL外，其它操作條件同福林法測定( 4、2)中的反應、靜止沉淀，直到過濾。濾液用紫外分光光度計，在275nm波長下，用10mm比色皿，測定其吸光度(A)。

5 計算

X=A×K×8/2×1/10×n=2/5×A×K×n×E…………………(A4)

式中：X——樣品的酶活力，u/g(u/mL);

A——試樣溶液的平均吸光度;

K——吸光常數(shù);

8——反應試劑的總體積，mL;

2——吸取酶液2.00mL，以1min計;

1/10——反應時間10min，以1min計;

n——稀釋倍數(shù)

E——紫外法與福林法的換算系數(shù)(中性、堿性蛋白酶系數(shù)為0.50;酸性蛋白

酶系數(shù)為0.77)。

所得結果表示至整數(shù)。

7 結果的允許差

平行試驗測定值之差不得超過3

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