THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)方法和注意事項(xiàng)

簡(jiǎn)介：

THP-1細(xì)胞是從急性單核細(xì)胞白血病患者外周血中分離出來的單核細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相關(guān)機(jī)制、信號(hào)通路等研究；形態(tài)和分化特性類似于原代單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在體外，常用PMA（phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯）或1α，25(OH)2D3 (1α，25-二羥基維生素D3或vD3)誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。因此，THP-1單核細(xì)胞已被開發(fā)為體外極化單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的有吸引力的模型。

原理：

一、THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)方法

1.細(xì)胞復(fù)蘇

準(zhǔn)備工作：15/50mL的離心管，馬克筆，培養(yǎng)瓶（T25）/培養(yǎng)皿（直徑60mm），RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），雙抗（PS），酒精瓶（消毒殺菌）+酒精棉球，離心管/試劑管架子，移液槍，tip頭（1000/200ul）。

（1）首先用酒精棉球擦拭細(xì)胞房的實(shí)驗(yàn)臺(tái)子，將我們所需要上述物品放入臺(tái)子里，并用紫外照30min，此時(shí)打開水浴鍋42℃。

（2）照完紫外后，將保存在-80℃或者液氮中的細(xì)胞拿出用一次手套包住并迅速放入42℃水浴鍋中，一般在1min中內(nèi)解凍。

（3）通過傳遞箱將細(xì)胞拿進(jìn)細(xì)胞房，打開照明，打開細(xì)胞臺(tái)子的玻璃門，用酒精噴灑手和細(xì)胞凍存管將細(xì)胞拿進(jìn)臺(tái)子里，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。

（4）配置培養(yǎng)基：以50ml離心管為例：RPMI 1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清+ 1%雙抗：500ul雙抗（PS）+5mL(10%)/7.5(15%)胎牛血清（FBS）+RPMI 1640培養(yǎng)基加至50mL，并做好標(biāo)記（培養(yǎng)基成分+配置時(shí)間+個(gè)人標(biāo)記（名字））。

（5）首先準(zhǔn)備一只15ml離心管，將細(xì)胞凍存管內(nèi)的細(xì)胞以及凍存液吸取至離心管中，加入2mL 步驟（4）中配置好的RPMI 1640培養(yǎng)基，700~800rpm ，低速離心5min。

（6）離心的時(shí)間，準(zhǔn)備T25培養(yǎng)瓶或者直徑60mm的培養(yǎng)皿做好標(biāo)記（細(xì)胞名稱+復(fù)蘇時(shí)間+姓名）。離心完成后，棄上清，吸取1ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

（7）吸取2-3ml新鮮培養(yǎng)基至準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，再將1ml細(xì)胞重懸液吸取至T25瓶或培養(yǎng)皿，“十字"搖勻細(xì)胞。

（8）用酒精噴灑后，將細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天觀察細(xì)胞狀態(tài)。

注意：細(xì)胞在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)更快，當(dāng)培養(yǎng)基稍微變黃（呈橘紅色）時(shí)，比較適合細(xì)胞生長(zhǎng)。

2、細(xì)胞傳代

THP-1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞且具有低密度依賴性，一般超過10^6/ml傳代，比例一般為1:3/1:4，因此目前利用的兩種傳代方式：

(1)半換液傳代（不用離心）:吸取培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中的細(xì)胞移至新的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)基2-3ml。

(2)傳統(tǒng)的離心傳代：將瓶子或皿中的細(xì)胞吸取至15mL離心管中，700-800rpm，離心5min；棄上清，吸取2-3ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分至新的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中并補(bǔ)足培養(yǎng)基2-3ml。

3、細(xì)胞凍存

（1）用10%DMSO：900ul FBS + 100ul DMSO （有毒小心操作）或直接用無血清細(xì)胞凍存液。

（2）收集生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞于15 mL離心管中，一般細(xì)胞數(shù)目為5×10^6-10^7/ml，700-800 rpm離心5 min，在超凈工作臺(tái)中用槍頭盡量去掉上清。

（3）加入1 mL凍存液，輕輕吹勻。將細(xì)胞放入梯度降溫盒中，放入-80℃培養(yǎng)箱中幾天后，轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

注意事項(xiàng)或培養(yǎng)方面的經(jīng)驗(yàn)心得

（1）THP-1細(xì)胞凍存后復(fù)蘇困難，因此要保證凍存的細(xì)胞數(shù)目足夠5×10^5-10^6個(gè)cell/ml；否則細(xì)胞密度過低，復(fù)蘇后狀態(tài)不好。

（2）培養(yǎng)過程中如果存在細(xì)胞碎片，可等待細(xì)胞長(zhǎng)起來后，通過低速離心去除。

（3）細(xì)胞發(fā)生少量聚團(tuán)時(shí)我們可以等待THP-1細(xì)胞密度擴(kuò)大后改善這種情況，但發(fā)生嚴(yán)重聚團(tuán)時(shí)我們可以提高血清（FBS）用量，或者適度吹散細(xì)胞。

（4）THP-1細(xì)胞在傳代后可能會(huì)出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，如輕微貼壁可以輕 吹收集細(xì)胞或者丟棄貼壁的細(xì)胞，貼壁較多時(shí)，可檢查培養(yǎng)條件是否合適。

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中復(fù)蘇困難、聚團(tuán)問題分析

1、復(fù)蘇困難

THP-1細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度具有高度依賴性。凍存時(shí)，密度一般為5×10^6-10^7/ml較為適宜；同時(shí)復(fù)蘇密度也有依賴性，建議不低于3×10^6/ml。當(dāng)細(xì)胞傳過幾次代，狀態(tài)較好時(shí)，傳代密度維持在5×10^/ml-10^6/ml較為合適，超過2×10^6/ml可進(jìn)行傳代。培養(yǎng)過程中如有細(xì)胞碎片，等細(xì)胞密度增大后可以通過低速離心去除。

2、細(xì)胞聚團(tuán)嚴(yán)重

細(xì)胞聚團(tuán)可能是細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺失或者受到損傷，所以共用了細(xì)胞膜，以便于彼此釋放的促進(jìn)生長(zhǎng)的因子可以被很快接收到，細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后，可吹打開，離心，然后換液。另外，THP1細(xì)胞離心速度一般不要高于800rpm，實(shí)驗(yàn)室常用600-700rpm，否則可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

（1）THP-1細(xì)胞在密度較稀時(shí)，有少量細(xì)胞聚團(tuán)屬于正常現(xiàn)象，我們需使用面積小的培養(yǎng)瓶（T25瓶）或者培養(yǎng)皿（直徑60mm），培養(yǎng)基用量也相應(yīng)減少，不建議將聚團(tuán)的細(xì)胞吹散，等待密度高時(shí)，細(xì)胞會(huì)自然分散開。

（2）當(dāng)細(xì)胞密度高時(shí)，聚團(tuán)細(xì)胞比例高于30%時(shí)，聚團(tuán)嚴(yán)重。細(xì)胞間界線不清晰，細(xì)胞團(tuán)模糊且較大等現(xiàn)象，則這種細(xì)胞聚團(tuán)是異常的。此時(shí)，若對(duì)細(xì)胞沒有做過任何外界刺激或?qū)嶒?yàn)處理，可檢查培養(yǎng)條件，一般更換優(yōu)質(zhì)血清或提高血清用量看是否有助于解決聚團(tuán)問題。

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