Western Blot全流程實(shí)驗(yàn)步驟及常見問(wèn)題詳解

一、原理

蛋白質(zhì)免疫印跡法即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，基本原理是經(jīng)過(guò) PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

二、流程圖：

(一)蛋白上清液提?。?/strong>

a、準(zhǔn)備工作：分裝需要體積的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分別加蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：PMSF 體積比為100:1），磷酸化蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制劑體積比為100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprotinin 蛋白酶抑制劑，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）體積比為 100:0.2；

b、剪取適量組織（盡量保證每一粒樣品都剪去的一樣多）和適量混勻的蛋白裂解液于勻漿器中磨勻（0.01g組織加上50-100ul的蛋白裂解液），直至看不見組織塊；

c、轉(zhuǎn)移勻漿液于 1.5ml 離心管中，置于冰上蛋白裂解10min；

d、提前開離心機(jī)預(yù)冷，4℃，12000rpm 離心 15min ；

e、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5ml 新的離心管中，部分用于實(shí)驗(yàn)多余的存于-20℃；

若實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞

懸浮細(xì)胞：

①收細(xì)胞：細(xì)胞懸液收集到離心管中，5000rpm，去上清，加1mlPBS，5000rpm，5min，加50ulIP/RIPA裂解液，冰上裂解20-30min；

②打蛋白：超聲儀，探頭使用前用純水清洗，探頭伸入液面以下，避免太多；設(shè)置程序：（打3s，停3s，共計(jì)92次）；破碎細(xì)胞后，4℃，12000rpm，10min離心，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃。

注意：

①貼壁細(xì)胞：先用PBS緩沖液清洗兩遍，然后加入蛋白裂解液（IP/RIPA），然后用細(xì)胞刮板將細(xì)胞+蛋白裂解液移至離心管中。

②一管細(xì)胞打20次左右，打蛋白的過(guò)程中會(huì)發(fā)熱，可暫停置于冰上數(shù)秒。

BCA測(cè)蛋白濃度：（通常利用BCA試劑盒測(cè)定），基本流程如下：

96孔板：（一般最外圍的孔不利用或加等體積的PBS溶液防止污染和蒸發(fā)）

（1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA做標(biāo)曲，取7個(gè)EP管，編號(hào)①-⑦

（2）濃度：①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0（單位：mg/ml）

（3）②-⑦+50ulPBS，①-②+50ulBSA

（4）②混勻，取50ul加③，依次加到⑥

（5）配樣品濃度：45ulPBS+5ul樣品濃度，配完短暫離心混勻（計(jì)算濃度時(shí)×10）

（6）配制工作液，配完避光，現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=50:1，一個(gè)孔要200ul工作液）：一個(gè)樣要2個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算體系：7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品+1個(gè)待測(cè)液溶液×2，共計(jì)16孔；防止加樣誤差，配置20個(gè)體系，一個(gè)200ul（20×200=4000ul/4ml）

（7）加樣到96孔板：一個(gè)孔：20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液；標(biāo)準(zhǔn)品從⑦-①加，兩個(gè)平行孔一起加。

（8）37℃孵育30min（孔板底部勿觸碰，保持干凈）

1. 測(cè)562nm處OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（excel）
   
   

(三)電泳

1、配制上樣體系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS 蛋白上樣量：20-50ug

5、蓋上電源蓋，正負(fù)極相互對(duì)應(yīng)，接通電源，恒壓濃縮膠80V，30min或maker分離后可更改電壓為120v，跑分離膠。待 loading buffer中的溴酚藍(lán)跑至腳底部 1cm 處停止電泳。整個(gè)時(shí)間大概為 1.5h-2h。

2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。

注意：一抗，二抗孵育洗膜時(shí)間可以靈活調(diào)整，一般3-5次，5min一次

Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀釋液

致局部短路，也散發(fā)熱量。

2、條帶畸形最主要可能是膠沒有混勻，轉(zhuǎn)膜過(guò)程中膠與膜中間有氣泡。條

帶拖尾，應(yīng)該是蛋白雜質(zhì)較多。

3、 配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時(shí)洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看

似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會(huì)凝結(jié)肉眼無(wú)法分辨的膠顆?；蚋泶?，可能會(huì)導(dǎo)致在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過(guò)該處或電泳散熱不好，條帶變形。

4、背景深

（3）縮短二抗孵育時(shí)間；

5 、沒有條帶

若麗春紅染色沒有條帶，則可以放棄此膜，轉(zhuǎn)膜前面的步驟哪里出錯(cuò)，有可能蛋白濃度低或蛋白未提出。

6 、曝光過(guò)后，若是β-actin 這樣的內(nèi)參很明顯的降解成了兩條帶，則說(shuō)明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巰基乙醇這類的還原劑失效。

9 、APS（過(guò)硫酸銨）會(huì)失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個(gè)月左右，APS失效膠會(huì)不凝，要4℃避光保存。

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