酵母雙雜交(Y2H)實驗操作指南

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid，Y2H) 常用于分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。將兩種蛋白質(zhì)分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）上，構(gòu)建成融合表達載體，從而分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。

一、酵母感受態(tài)細胞制備

(1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)4-7d。

(2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養(yǎng)液中。

(3) 30℃培養(yǎng)，200rpm 震蕩培養(yǎng)8h。

(4) 當菌液OD值約為0.3時，轉(zhuǎn)移10uL菌液到含50mIYPDA培養(yǎng)液中。

(5) 30℃培養(yǎng)，200rpm震蕩培養(yǎng)16-20h至OD值為015-0.3。

(6) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細胞。

(7) 將底部沉淀使用已預(yù)熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細胞。

(8) 30℃，200rpm，搖3-5h至OD值=0.6時。

(9) 5min室溫離心收集細胞。

(10) 將底部沉淀在30mL無菌超純水中重懸酵母細胞.

(11) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細胞。

(12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細胞。

(13) 將懸重懸細胞分成2管，6000g轉(zhuǎn)速室溫離心30s。

(15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細胞，分裝為100uL每管。

二、轉(zhuǎn)化

（1）在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。

（2）每個離心管中加入100 µL的酵母感受態(tài)細胞，500 µL的PEG/LiAc溶液，加入兩種質(zhì)粒，并且將管中的混合物進行旋渦振蕩，將其混勻。

（3）在30℃，220 rpm/min的搖床振蕩培養(yǎng)30 min。

（4）往每個離心管中加70 µL的DMSO，并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min（每隔10 min搖勻1次）。

（5）取出離心管，在冰上靜置2 min。

（6）吸取100 µL并涂布在相應(yīng)的二缺固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，待菌長好后，挑單菌落于10ulYPDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。

互作驗證：

取過夜培養(yǎng)的菌液涂布于四缺平板上，將培養(yǎng)皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否生長與顏色變化。

注意事項：

（1）檢測感受態(tài)細胞效率，標準操作規(guī)范。

（2）注意質(zhì)粒使用量，檢查儀器狀態(tài)。

（3）配制新鮮培養(yǎng)基，并做對照轉(zhuǎn)化，添加抑制劑，同時增設(shè)嚴格的對照組防止自激活。

（4）應(yīng)挑選大的、新鮮的菌株克隆進行培養(yǎng)。

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