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    細(xì)胞計數(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟＆問題分析

    發(fā)布時間： 2024-04-25　　點(diǎn)擊次數(shù)： 542次

    細(xì)胞計數(shù)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中是非常常見的，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室目前使用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)如下圖所示：

    細(xì)胞計數(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟＆問題分析

    實(shí)驗(yàn)步驟

    1.所用細(xì)胞密度達(dá)到一定要求后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)鋪板，提前準(zhǔn)備好細(xì)胞計數(shù)板、蓋玻片、計數(shù)器；

    2.棄掉原有培養(yǎng)基，加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗；

    3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細(xì)胞，消化時間根據(jù)細(xì)胞類型及日常經(jīng)驗(yàn)決定；

    4.消化相應(yīng)時間后，加入二倍體積的培養(yǎng)基終止消化，用移液器將細(xì)胞全部吹下，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)；

    5.離心機(jī)室溫800rpm,離心5min；

    6.準(zhǔn)備和所計數(shù)細(xì)胞種類相同的1.5ml Ep管，各加入PBS緩沖液980ul備用；

    7.準(zhǔn)備細(xì)胞計數(shù)板，并在計數(shù)區(qū)蓋上蓋玻片；

    8.將5中離心結(jié)束的細(xì)胞棄上清，加入1ml培養(yǎng)基，充分混懸后取20ul加入到6中的Ep管中，充分顛倒混勻后取12ul加入牛鮑計數(shù)板一側(cè)的計數(shù)區(qū)內(nèi)，保證計數(shù)區(qū)充盈。

    9.低倍顯微鏡（物鏡4）下找到計數(shù)視野，上圖中“"B C D E“"區(qū)為細(xì)胞計數(shù)區(qū)。

    10.高倍鏡（物鏡10）下計數(shù)細(xì)胞，依次計數(shù)4個方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。

    11.計算細(xì)胞數(shù)量，假設(shè)4個方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為A,則每ml的細(xì)胞數(shù)量為：A/4×104×50（稀釋倍數(shù)）=B個。

    12.假設(shè)鋪板所需細(xì)胞密度為1×104個/ml，則所需8中的細(xì)胞混懸液的量為：1×104×C（培養(yǎng)基所需毫升數(shù)，如6孔板每孔加培養(yǎng)基2ml）/B=D ml，最后換算成μl即可。

    13.鋪板：取C ml培養(yǎng)基，加入8中細(xì)胞混懸液D μl，充分混勻后依次加入培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)即可。

    細(xì)胞計數(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟＆問題分析

    常見問題及注意事項(xiàng)
    1.鏡下計數(shù)細(xì)胞時，壓線細(xì)胞按照“計上不計下，計左不計右"的原則進(jìn)行，若有少量成團(tuán)細(xì)胞，則按1個細(xì)胞處理，若成團(tuán)細(xì)胞太多，說明在步驟8中，細(xì)胞不全部混懸，未能所有都分開成單細(xì)胞，因此需重新進(jìn)行上述步驟。
    2.需要鋪板的細(xì)胞長滿時數(shù)量較多，因此計數(shù)時稀釋倍數(shù)盡量大，取混懸液的每一步保證細(xì)胞充分混勻，計數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確。
    3.鏡下計數(shù)細(xì)胞時，最少計數(shù)兩次，取平均值為最終結(jié)果。

    4.細(xì)胞混懸液加入細(xì)胞計數(shù)板時，建議使用10μl小槍頭、2-20μl移液器，槍頭傾斜抵住蓋玻片邊緣，緩慢加入，務(wù)必保證細(xì)胞混懸液全部加入，計數(shù)區(qū)充盈。

    關(guān)于細(xì)胞計數(shù)，以如下實(shí)例來充分理解上述計算過程：

    1.假設(shè)實(shí)驗(yàn)要求最后鋪板密度為1×105個/ml，計劃以6孔板鋪板，擬使用4個孔，每孔2ml培養(yǎng)基，則所需細(xì)胞總數(shù)為：1×105×2ml×5孔=1×106個。
    2.假設(shè)4孔細(xì)胞總數(shù)為100個，則細(xì)胞密度為：100/4×104×50（稀釋倍數(shù)）=1.25×107個/ml。
    3.最終所需細(xì)胞懸液量為：1×106/1.25×107=0.08ml=800μl

    4.鋪板：培養(yǎng)基5孔（為防止不夠所以多準(zhǔn)備1孔）2ml×5孔=10ml加入細(xì)胞混懸液800μl，混勻加入六孔板即可。

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