分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--二、TOPO克隆

2. 建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的 PCR 擴(kuò)增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。

PCR產(chǎn)物的純化回收
1.PCR 反應(yīng)后，產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；

2.推薦使用切膠回收的方式純化 ( 切膠時(shí)間最好控制在 3min 內(nèi)，避免紫外照射對(duì) DNA 的損傷 )，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測(cè)，濃度應(yīng)當(dāng)≥ 30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；

目的片段連接至載體

1.連接反應(yīng)體系按照說明書要求投入，各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用；

2.連接反應(yīng)溫度可嘗試 25°C或 37°C，時(shí)間 5min，若不長(zhǎng)克隆或克隆空載體 / 假陽(yáng)性，時(shí)間可嘗試延長(zhǎng)至 30min；

感受態(tài)轉(zhuǎn)化涂板

1.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞；

2.感受態(tài)細(xì)胞不可反復(fù)凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；

3.重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細(xì)胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細(xì)胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細(xì)胞；

4.熱激時(shí)間：按照感受態(tài)細(xì)胞說明書操作進(jìn)行；

5.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致；

6.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。

單克隆菌落PCR鑒定

1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落；

2.挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落進(jìn)行鑒定分析；

3.挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為PCR 反應(yīng)（10/20μl 體系）模板；

4.推薦使用一對(duì)分別位于片段和載體的上下游引物進(jìn)行 PCR 鑒定。