細胞培養(yǎng)時如何對器皿進行表面處理？

    科學家們發(fā)現(xiàn)，在缺乏血清條件下，克隆細胞必須以濃度為1mg/ml的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，同樣的技術(shù)也可以促進神經(jīng)突觸的生長。其中，多聚-D-賴氨酸（PDL）異構(gòu)體優(yōu)于多聚-L-賴氨酸（PLL），因為前者不容易被細胞外液蛋白酶水解，但目前兩者都在使用。

    Poly-L-lysine的中文名為多聚賴氨酸，簡稱PLL，是通過鏈霉菌屬的細菌菌株自然發(fā)酵生產(chǎn)聚賴氨酸。

貼壁依賴性細胞，通過包被帶正電的高分子多聚賴氨酸，可以提高無血清或低血清培養(yǎng)環(huán)境下的細胞貼壁率，加強培養(yǎng)器皿表面對血清蛋白和細胞外基質(zhì)蛋白的吸附，加快細胞的增殖。

    多聚賴氨酸（ScienCell，貨號：0403/0413）包被多適用于神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)，能夠促進神經(jīng)細胞分化和神經(jīng)突的生長。

    膠原（collagen）是哺乳動物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，廣泛存在于從低等脊椎動物的體表面到哺乳動物機體的一切組織中。它是支持細胞和組織生長的重要胞外基質(zhì)蛋白，其形成的胞外環(huán)境有利于多種細胞的粘附、生長、遷移和分化。用變性膠原處理后能改善多種細胞的附著能力，如上皮細胞；而天然未變性的膠原可能是細胞分化功能表達所必需的。

    明膠是一種大分子非均質(zhì)親水膠體，是膠原部分水解后得到的水溶性蛋白多聚體，明膠與膠原具有同源性。實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包被明膠有利于肌肉細胞和內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)。

    明膠溶液（ScienCell，貨號：0423）與多聚賴氨酸一樣，也是一種粘附劑，涂覆在容器表面可以促進細胞貼壁生長。推薦用于培養(yǎng)分化的人類胚胎干細胞、某些原代細胞和永生化細胞。

    明膠因其具有較高的生物相容性、生物可降解性且體內(nèi)降解后不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物、無免疫原性和血液相容性以及具有與膠原相同的組分和生物性質(zhì)，也廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物遞送系統(tǒng)中。

    基質(zhì)成分包括層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白等，其中許多是天然產(chǎn)物，如果化學成分不*明確，則需要一定的純化。當然，細胞外基質(zhì)中的許多成分都可以作為重組蛋白使用，因此成分明確，可以純化。

    纖連蛋白（Fibronectin, FN），也稱為纖維連接蛋白，是一種廣譜的、天然的細胞粘附因子。它主要由肝臟及血管內(nèi)皮細胞生成，廣泛存在于血漿、多種細胞表面及細胞基質(zhì)中，一種高分子量的非膠原性糖蛋白，分子含糖量4.5－9.5％可以與血纖蛋白、肝素、膠原、DNA以及細胞表面受體結(jié)合，而且具有多種細胞生物學功能，廣泛參與細胞的遷移、粘附、增殖、止血及組織修復(fù)的過程。

    常用于細胞培養(yǎng)的纖連蛋白一般為牛血漿纖維粘連蛋白（ScienCell，貨號：8248）或人纖連蛋白（ScienCell，貨號：8488；中喬新舟，貨號：CSP044）。

    纖連蛋白作為細胞培養(yǎng)的基質(zhì)，可提高多種細胞的貼壁率、匯合率，縮短細胞匯合時間，使細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，代謝率增強，DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成速度顯著提高；細胞的集落率升高，原代培養(yǎng)成活率提高。

    雖然表面有惰性包被已經(jīng)足夠了，但仍然有必要利用合適的單層細胞培養(yǎng)物為某些特殊細胞類型提供合適基質(zhì)。如用去污劑去除匯合的小鼠成纖維細胞（3T3）、人成纖維細胞（MRC-5）等的單層細胞后，殘留的細胞外基質(zhì)（ECM）能促進卵巢顆粒細胞的分化、研究腫瘤細胞行為及血管形態(tài)發(fā)生。

    基質(zhì)覆蓋有助于細胞的附著、生長和分化。但對于一些較難培養(yǎng)的細胞，尤其是低細胞密度下更難培養(yǎng)的細胞，需要活細胞來維持。原因可能是成纖維細胞的代謝物滲漏，或是成纖維細胞分泌生長因子對培養(yǎng)基的補充，也可能由于細胞產(chǎn)物優(yōu)化了細胞的附著面。生長成匯合單層細胞的飼養(yǎng)層可為其他細胞附著提供一個合適的甚至是選擇性的表面。例如，單層神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以促進中樞和外周神經(jīng)元的存活及生長，雖然這種情況是由擴散因子而不是直接的細胞接觸引起的。

    飼養(yǎng)層細胞大部分可用小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），而飼養(yǎng)層細胞大都用于培養(yǎng)胚胎干細胞。

    當然，有時我們不希望細胞附著生長，例如培養(yǎng)非貼壁依賴性的細胞（懸浮細胞）時，可通過將細胞接種到瓊脂中的方法來實現(xiàn)，因為在這些基質(zhì)中未轉(zhuǎn)化的細胞不易形成集落。目前最為常用到的是瓊脂、瓊脂糖或Methocel（甲基纖維素）。前兩種為凝膠，第三種為高粘度溶膠。因為甲基纖維素是溶膠，細胞可以在其中緩慢下沉，因此經(jīng)常在其下面放一層瓊脂。在非組織培養(yǎng)基的器皿上不涂瓊脂層也能達到細胞培養(yǎng)的目的，但有時會出現(xiàn)細胞附著和鋪展。