原代細(xì)胞培養(yǎng)

原理

鼠胚原代培養(yǎng)是原代培養(yǎng)一個(gè)類型，是指從孕鼠中剖取適宜胎齡的胎鼠，從特定組織中分離出細(xì)胞，在適宜條件下增殖培養(yǎng)，直到它們占據(jù)所有可用的基質(zhì)（即達(dá)到匯合狀態(tài)）的培養(yǎng)階段。在此階段，必須通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮生長培養(yǎng)基的新容器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)（即傳代），以為其提供更多的繼續(xù)生長空間。

用途

1、藥物篩選實(shí)驗(yàn)；
2、信號(hào)通路與機(jī)制研究；
3、生物制品的生產(chǎn)(如制備單克隆抗體）等 

材料與儀器

【儀器設(shè)備】超凈工作臺(tái)、濾器、CO2 培養(yǎng)箱、電熱干燥箱

【器械及器皿】培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滴管、鑷子、手術(shù)剪

【試劑】:常用培養(yǎng)基還有：DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。

血清:一般常用為胎牛血清，人血清和其它動(dòng)物血清。

平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體,維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機(jī)離子等。常用的有PBS，Hank's 等。

抗生素:常用為青霉素和鏈霉素。

其它添加成分:緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES，在 20 度時(shí)為 7.55；37 度為7.31; HEPES 不是起維持 PH 恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速 PH 變化的，所以調(diào)整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。

有機(jī)補(bǔ)充物,如丙酮酸鈉，谷氨酰胺等。促細(xì)胞分裂因子，如生長因子類的 FGF、EDF。貼璧和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。

懷孕的母鼠、多聚賴氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液

步驟

1、胚鼠原代培養(yǎng)：

1.1 實(shí)驗(yàn)前，超凈工作臺(tái)或生物安全柜紫外燈提前照射 30 分鐘；

1.2 取材:取懷孕母鼠，頸椎脫臼法處死后，整個(gè)鼠體浸入盛有純酒精的燒杯中浸泡 1 分鐘。取出母鼠在不銹鋼手術(shù)盤中用無菌手術(shù)剪打開腹腔，取出鼠胚，放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意取材可在無菌操作臺(tái)外操作。

1.3 用 70-75% 酒精擦拭裝有鼠胚的培養(yǎng)皿外周后，將培養(yǎng)皿移至超凈工作臺(tái)或生物安全柜中，用含雙抗 Hanks 液洗滌鼠胚數(shù)遍卻除血污。在體視顯微鏡下進(jìn)行操作，用無菌手術(shù)器械去除多余組織，用解剖鑷剖取需要的組織，移入含解離液或培養(yǎng)基的 50 ml 離心管中，用眼科剪將組織剪碎成1立方毫米的肉糜狀；

1.4 在含組織的 50 ml 離心管中加入解離液或培養(yǎng)基至 10 ml。首先用 10 ml彎頭滴管對(duì)組織進(jìn)行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 槍頭的吹打組織，最后用 200 μl 的尖的一端進(jìn)行吹打；

1.5 將上述組織懸液通過 70 μm 過濾器過濾切碎和分散的組織懸浮液，然后 l200 rpm， 4℃ 離 10 分鐘；

1.6 棄掉上清，加入配置好的細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，將其置于于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中，三天后換液，以后每兩天換細(xì)胞培養(yǎng)液；

2、傳代培養(yǎng)

2.1 實(shí)驗(yàn)前，超凈工作臺(tái)或生物安全柜紫外燈提前照射 30 min，開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，酒精擦拭消毒雙手；

2.2 將原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代培養(yǎng)；

2.3 用酒精棉球擦凈操作臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)瓶口灼燒消毒；

2.4 倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，留下貼壁生長的細(xì)胞；

2.5 在培養(yǎng)瓶中加入適量 0.25 % 胰酶至剛好漫過貼壁生長的細(xì)胞即可，擰上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶置于37℃的培養(yǎng)箱中 5 min。在此期間，如果在顯微鏡下觀察可以看到細(xì)胞收回突起變成圓形。

2.6 取出培養(yǎng)瓶,輕輕搖晃培養(yǎng)瓶或吹打使細(xì)胞脫離瓶壁，將細(xì)胞懸液移至離心管中，4℃、800 rpm離心 5 min；

2.7 棄掉離心管中的上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞植于多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，再將其置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)細(xì)胞可以繼續(xù)分裂而傳代。

注意事項(xiàng)

1、原代培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

1）原代培養(yǎng)要重點(diǎn)注意無菌操作，所用器械需提前高壓滅菌；

2）因?yàn)槭笈咴囵B(yǎng)時(shí)，獲取組織較少，建議在冷光源體視顯微鏡下操作；

3）原代細(xì)胞培養(yǎng)過程比較慢,培養(yǎng)時(shí)間最少需要一周以上的時(shí)間。若 2 天后可能會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基變黃的現(xiàn)象,且無漂浮物,排除污染，屬于正?，F(xiàn)象,這是因?yàn)榧?xì)胞在貼壁生長過程中釋放了CO2 和其他物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)液 PH 發(fā)生了改變,所以變黃；

4）正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后,會(huì)逐漸貼滿整個(gè)瓶底或者皿底,呈現(xiàn)出相應(yīng)的形狀,有的呈纖維狀,有的星多邊形；

5）細(xì)胞的第一次傳代,一定要密度高一些傳代原代細(xì)胞傳代密度低,很難長起來。建議 1:2-13傳代如果細(xì)胞數(shù)量夠的條件下,P2-P3 代完成實(shí)驗(yàn)是最合適的。如果細(xì)胞數(shù)量不夠,那細(xì)胞的提取和培養(yǎng)比較重要,盡可能地讓細(xì)胞的好狀態(tài)多維持幾代對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗來說至關(guān)重要；

6）原代細(xì)胞不建議凍存,因?yàn)閮龃婧苋菀讖?fù)活不成功。如果要凍存的話,建議在 P2或P3 代凍存,一些比較難復(fù)蘇的細(xì)胞可以適當(dāng)提高凍存液中的血清濃度；

7）很多原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要加入生長因子,細(xì)胞才能正常的生長增殖和分化；

2、細(xì)胞傳代注意事項(xiàng)：

1）細(xì)胞離心時(shí)離心速度建議800-1000 rpm/min，4℃ 離心 5 分鐘，避免轉(zhuǎn)數(shù)過高，造成細(xì)胞破碎死亡；

2）消化時(shí)，注意觀察，切勿消化過度；

常見問題

1、當(dāng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)失去分裂能力了，而好的細(xì)胞應(yīng)該呈現(xiàn)長梭形，立體感強(qiáng)。因此，這些細(xì)胞不能用于傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。

2、理論上，在顯微鏡下可以觀察到梭形的細(xì)胞說明傳代培養(yǎng)成功。和原代培養(yǎng)的觀察類似。但是總的來說，我們實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是很好，觀察到的好的細(xì)胞很少。其原因可能和原代培養(yǎng)時(shí)候的相近。

3.對(duì)于不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞我們進(jìn)行了活性的觀察實(shí)驗(yàn)。

用臺(tái)盼藍(lán)染液染色，取 9 滴細(xì)胞液加 1 滴臺(tái)盼藍(lán)，染色不超過 3 分鐘，在顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)，有的細(xì)胞核被染成藍(lán)色，而有的細(xì)胞核沒有著色。

這是因?yàn)榧?xì)胞核被染色的細(xì)胞是死細(xì)胞，而未被染色的則是活細(xì)胞,通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以計(jì)算視野中細(xì)胞的存活率。

4、細(xì)胞增殖分化緩慢：有些原代細(xì)胞體外培養(yǎng)需要加入生長因子，細(xì)胞才可正常增殖和分化，因而，實(shí)驗(yàn)前要根據(jù)具體細(xì)胞配置相應(yīng)培養(yǎng)基；

5、細(xì)胞污染：細(xì)胞污染類型分為：物理污染、化學(xué)污染以及生物污染，因而原代培養(yǎng)要嚴(yán)格無菌操作，培養(yǎng)基專用專配不要交叉使用；

6、消化時(shí)，細(xì)胞長時(shí)間難以消化下來：胰酶使用前，需要在 37℃ 水浴鍋充分預(yù)熱，已達(dá)到最佳酶活性；