細(xì)胞增殖分析（CCK-8 法）

原理

CCK-8 是 MTT 的升級(jí)產(chǎn)品，其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。

生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，與細(xì)胞毒性成反比，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

用途

用于細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、藥物篩選、抗腫瘤藥物敏感性測(cè)定。

材料與儀器

【材料】細(xì)胞懸液

【試劑】 CCK8

【儀器，耗材】96 孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀

步驟

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)；

2、根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)接種到 96 孔板中，每孔約 200 ul（2×103-2×104/孔）細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做 3-5 個(gè)重復(fù)，將 96 孔板在 37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24,48,72 h；

3、設(shè)置空白對(duì)照組：不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照，其他試驗(yàn)步驟保持一致。細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4-8小時(shí)；

4、加入20ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入；

5、培養(yǎng)1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）；

6、測(cè)定 450 nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng) 450-490 nm，參比波長(zhǎng)600-650 nm。

注意事項(xiàng)

1、當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測(cè)定孔用。避免邊緣效應(yīng)。     

2、用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定，且要擦拭干凈樣品板。

3、細(xì)胞種板數(shù)不易過多，否則細(xì)胞自身發(fā)生接觸抑制，影響OD數(shù)值，較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間建議每孔加入200 μl培養(yǎng)基。                                    

4.若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。                 

5、懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

6、加入CCK-8 時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或 pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

常見問題

Q：96 孔板最邊緣的細(xì)胞吸光值都較大？

A：這是邊緣效應(yīng)導(dǎo)致的，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中，一般邊緣的孔中培養(yǎng)基揮發(fā)較多，培養(yǎng)基中各成分相對(duì)濃縮，細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)更快，不能正確反映真實(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，所以需要棄用周圍一圈孔板，加入培養(yǎng)基或 PBS。