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    一氧化氮合酶組化顯示法

    發(fā)布時間： 2023-01-13　　點擊次數(shù)： 818次

    簡介

    細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀。

    原理

    一氧化氮合酶組化顯示實驗的基本原理是細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位。

    材料與儀器

    器材：

    染色缸、載玻片、蓋片、24孔板、毛筆、解剖器材、灌注器材、冰凍切片機(jī)、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠。

    試劑：


    ①孵育液（NADPH、NBT）
    （還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ；硝基四氮唑藍(lán)(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L  PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;
    ②0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（PB）


    （磷酸二氫鈉（NaH2PO4•2H2O），3 g ；磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O），29 g ；加少量蒸餾水，調(diào) pH 7.2～7.4，最后定容至1000 mL ）;

    ③1％Triton X-100。
    ④3％Triton X-100
    ⑤1％中性紅
    ⑥梯度乙醇
    ⑦0.01 mol ／ L PBS
    ⑧4％多聚甲醛
    ⑨中性樹膠

    步驟

    一氧化氮合酶組化顯示實驗的基本過程可分為如下幾步：


    （一）腦組織冰凍切片


    A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，浸30％蔗糖后行冰凍切片（片厚40 μm ）。

    B．將切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ，重復(fù)3 次 。

    C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中，室溫，預(yù)浸60 min 。

    D．浸入孵育液中孵育，37 ℃ ，3 h 。

    E．3％Triton X-100,4 ℃ ，過夜。

    F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    G．裱片，風(fēng)干。中性紅復(fù)染。

    H．常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

    （二）細(xì)胞爬片或甩片


    A．細(xì)胞爬片或甩片，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。

    C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ，重復(fù)3 次 。

    D．按上述腦組織冰凍切片步驟（3）～（6）操作。

    E．中性紅復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

    注意事項

    1．冰凍切片采用的是漂浮法，有利于孵育液充分進(jìn)入組織。

    2．本方法屬于酶組化，要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉颓‘?dāng)?shù)墓潭〞r間和方法，否則會影響酶的活性。

    3．此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果，降低非特異性背景染色。但 Triton X-100 預(yù)浸時間不能超過2 h ，孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2％，否則影響著色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 難溶。


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