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    一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗

    發(fā)布時間： 2023-01-13　　點擊次數(shù)： 971次

    簡介

    目前免疫組化多選用 SABC 法。

    一抗是特異性的針對檢測蛋白的單克隆或多克隆抗體（本實驗為兔抗大鼠 iNOS ）。

     

    二抗是生物素標記的針對一抗的抗體（本實驗為羊抗兔 IgG ）。

     

    三抗是針對生物素的鏈霉親和素-過氧化物酶復合物（streptavidin biotin complex，SABC）。

     

    這樣就可以通過逐級放大的方式，以過氧化物酶標記要檢測的蛋白（iNOS）。顯色液為二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和雙氧水（H2O2）。

     

    顯色原理：過氧化物酶將 H2O2 分解，產(chǎn)生新態(tài)氧，使 DAB 氧化，生成棕黃色顆粒產(chǎn)物，可根據(jù)顏色反應來判定一氧化氮合酶的有無或多少。本方法具有靈敏性高，背景低的優(yōu)點。

    原理

     一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗的基本原理是一氧化氮合酶按調控條件分為組構型（cNOS）和誘生型（iNOS）。前者按細胞類型又可分為神經(jīng)元組構型（nNOS）和內皮細胞組構型（eNOS）。前述的組化方法不能區(qū)分上述 NOS 的具體分型，因此可以利用針對不同類型 NOS（nNOS、eNOS、iNOS）的特異性抗體，通過免疫組化方法進行顯示。

    材料與儀器

    器材：

    染色缸、載玻片、蓋片、吸管、吸水濾紙、小鑷子、解剖器材、灌注器材、石蠟切片機、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學顯微鏡、大鼠或培養(yǎng)的細胞。

    試劑：
    ①兔抗大鼠 iNOS（一抗）
    ②羊抗兔 SABC 試劑盒［10％正常山羊血清、羊抗兔 IgG（二抗）、SABC（三抗）］
    ③3％H2O2-甲醇液
    ④0.01 mol ／ L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）
    ⑤0.01 mol ／ L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）
    ⑥ DAB 顯色液（DAB，6 mg ；0.05 mol ／ L PBS（pH 7.4），10 mL ；30％H2O2,0.01 mL 。過濾去除沉淀物。用時現(xiàn)配）
    ⑦雙氧水
    ⑧蘇木精染液
    ⑨梯度乙醇
    ⑩二甲苯
    ?4％多聚甲醛
    ?石蠟
    ?0.3％Triton X-100。

    步驟

    一氧化氮合酶免疫組化顯示實驗的基本過程可分為如下幾步：

     

    （一）腦組織石蠟切片


    A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，常規(guī)包蠟塊。

    B．石蠟切片，片厚5 μm 。

    C．常規(guī)脫蠟入水。

    D．0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    E．封閉內源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇，室溫，15 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    F．抗原熱修復：將切片浸入0.01 mol ／ L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），用微波爐或電爐熱處理（加熱至95 ℃ 后斷電，間隔5～10 min ，反復1～2 次 ）。自然冷卻后，在0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    G．封閉非特異抗原：向切片上滴加10％正常山羊血清，室溫或37 ℃ ，20～30 min 。甩去多余的血清，不洗。

    H．一抗孵育：滴加適當稀釋的一抗（兔抗大鼠iNOS），放入濕盒中，4 ℃ ，過夜。以  PBS 代替一抗做陰性對照。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    I．二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔 IgG ，37 ℃ ，30 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    J．三抗孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復合物（SABC），37 ℃ ，30 min 。0.01 mol ／ L PBS中漂洗5 min ，重復3 次 。

    K．顯色：用 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下監(jiān)測，適時終止。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    L．蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片。

    （二）細胞爬片或甩片


    A．細胞爬片或甩片，0.01 mol ／ L PBS 漂洗5 min ，重復3 次 。

    B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。0.01 mol ／ L PBS 漂洗5 min ，重復3 次 。

    C．封閉內源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇，室溫，10 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    D．暴露抗原：0.3％Triton X-100，室溫，10 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    E．封閉非特異抗原：滴加10％正常山羊血清，室溫或37 ℃ ，20～30 min 。甩去多余的血清，不洗。

    F．一抗孵育：滴加適當稀釋的一抗（兔抗大鼠iNOS），濕盒中，4 ℃ ，過夜。以不加 PBS 代替一抗做陰性對照。0.01 mol ／ L PBS中 漂洗5 min ，重復3 次 。

     

    G．二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔 IgG ，37 ℃ ，1 h 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。


    H．三抗孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復合物（SABC），37 ℃ ，1 h 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    I．顯色：用 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下監(jiān)測，適時終止。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復3 次 。

    J．蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片。

    注意事項

    1．一抗的質量是關系到實驗結果的最關鍵因素，一定要選用高質量的抗體。

    2．一抗、二抗、三抗的稀釋濃度、孵育時間、孵育溫度是十分重要的環(huán)節(jié)。在實際操作中，應根據(jù)自身實驗室的條件探索合適的制備方法。

     

    3．DAB 顯色液應現(xiàn)用現(xiàn)配，最早在使用前15 min 配制。

    4．實驗操作過程中防止出現(xiàn)干片，否則會出現(xiàn)假陽性。為了正確估計是否是因為操作過程造成的人工假象，設立陰性對照十分必要。

    5．細胞爬片固定時采用室溫，是為了防止細胞脫落。以后每步操作都要小心，防止細胞脫落。

     

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