CHO細胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)驗分享

簡介：
CHO細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）一個轉(zhuǎn)化細胞系，1957年從中國倉鼠卵巢細胞得到。CHO細胞目前是現(xiàn)代制藥企業(yè)進行研發(fā)、生產(chǎn)生物治療藥物 (單抗、酶、激酶和激素等) 中常用的非人類哺乳動物細胞系。

原理：
培養(yǎng)基無特殊要求，可有多種選擇,一般用DMEM（高糖）培養(yǎng)基+10%胎牛血清+2%雙抗。置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔48h換液，或當培養(yǎng)基呈現(xiàn)熒光黃色及時換液，否則細胞會出現(xiàn)大規(guī)模脫落和變形死亡。

當單層培養(yǎng)細胞匯合達90%以后(兩天左右)，棄去培養(yǎng)基，用2ml不含鈣、鎂離子的PBS潤洗2次，用0.5mlPBS+0.5ml 含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養(yǎng)箱放30s-1min），鏡下觀察變圓或輕輕擊打培養(yǎng)皿側(cè)壁發(fā)現(xiàn)有細胞團塊脫落或皿底花斑狀，用1ml（血清）細胞培養(yǎng)基終止消化，九宮格法吹落細胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。

以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細胞培養(yǎng)基充分重懸細胞沉淀成單個細胞，以“Z"字打入含有7ml培養(yǎng)基的10cm皿中，輕柔十字晃勻不超過十下并靜置數(shù)分鐘后鏡下觀察，平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱中。

凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。取長勢良好，匯合度達90%并無污染的細胞，消化離心后用凍存液1.5ml重懸后轉(zhuǎn)移至凍存管中，標記好細胞種類、日期、姓名，放入恢復室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。

準備好離心管中放入3ml（血清）細胞培養(yǎng)基，并確保水浴鍋打開并達到37℃，從-80℃冰箱取出目標凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3mL培養(yǎng)基混合均勻。在800 rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養(yǎng)基重懸細胞為單個細胞狀態(tài)，加入10cm皿中，培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

注意事項：

1.CHO細胞對損傷不易耐受，請注意密切觀察。

2.不同胰酶消化速度有差別，根據(jù)經(jīng)驗調(diào)整用量和用時。

3.細胞傳代用PBS洗的目的是去除舊培養(yǎng)基中血清對胰酶的抑制作用。

4.不要將細胞中液體吸凈后放置過久，細胞變干后死亡。

5.細胞消化所用胰酶的最適工作溫度大約在37攝氏度左右，故放入培養(yǎng)箱更好的促進胰酶消化。

6.細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，才能最大限度的保存細胞活力。（細胞保護劑（DMSO）能提高細胞膜對水的通透性，緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇時快速融化，避免由于緩慢融化使細胞外結(jié)晶的水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷）。

7.細胞凍存嚴格遵循梯度降溫，不可直接放入低溫冰箱，如果沒有梯度凍存盒，可以4℃ 10-30min，-20℃ 30-1h，-80℃過夜。

8.復蘇后第二天換液是為了去除殘留凍存液對細胞的傷害。

9.細胞量少或凍存過久的細胞復蘇到中皿中，等長滿后傳代到大皿中。

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