劃痕實驗（細胞遷移）的實驗流程及經(jīng)驗分享

簡介：
細胞遷移(Cell migration)：因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實驗(Wound healing assay)，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動?？捎糜诳梢杂^察藥物、基因等外源因素對細胞遷移、修復和相互作用的影響。
 

原理：
在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口"，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕/傷口"愈合，于細胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測量不同時間點的劃痕間距并計算差值，可對細胞的遷移能力做出判斷。

材料及儀器：
耗材：六孔板、馬克筆、直尺、200ul槍頭、PBS、（血清）細胞培養(yǎng)基等。

實驗步驟：

1.劃線：于六孔板底面，馬克筆順直尺畫三條橫線作為標記線。

2.種板：根據(jù)分組種板，細胞密度為5x105個/孔左右。并務必鋪勻。

3.劃痕：待細胞長滿后，用直尺比著，200ul槍頭垂直于孔板和畫的標記線劃兩條垂線，使劃痕與標記線相交，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點。

4.清洗：棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗兩到三次，直到劃下來的細胞沖洗干凈。

5.加液：根據(jù)分組分別加入加藥培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。

6.拍照觀察：劃痕、清洗、加液完成后，用顯微鏡拍不同倍數(shù)的照片，作為0h對照。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在所需時間點取出細胞，于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。

7.數(shù)據(jù)分析：一種是統(tǒng)計細胞遷移的距離，一種是統(tǒng)計劃痕面積。都可以用ImageJ軟件來進行分析。

注意事項或經(jīng)驗分享：

1.直尺和馬克筆等工具用前務必照紫外消殺。
2.種板所用細胞數(shù)目可根據(jù)細胞的生長快慢調(diào)整接種數(shù)量。保證每組細胞鋪板密度一致，保證每孔務必鋪勻。
3.提前用馬克筆畫好線，避免細胞種板后不好操作。槍頭畫線之前，不要棄去原培養(yǎng)基，否則劃下來的細胞團塊會堆積在劃痕邊緣上堆積導致寬度不統(tǒng)一。
4.用槍頭畫線時，要用力均勻一致，垂直穩(wěn)定一氣呵成，避免寬度差別較大不利于結(jié)果分析的準確性。
5.根據(jù)交叉點定位拍照，避免了前后觀察時位置不固定的問題，結(jié)果更有說服力。
6.務必清洗干凈劃下來的活細胞，避免在拍照期間細胞貼壁在劃痕處并進行增殖影響結(jié)果。
7.0h拍照時可以在試驗記錄本上標記拍照位置，以便下各時間段拍攝同一位置。
8.拍照時注意不要露出馬克筆畫的線條，不要鏡頭過于模糊，盡量不要選擇邊緣的光影差別過大的位置，切換鏡頭時不要忘記換標尺，否則都會影響結(jié)果的自動分析。
9.根據(jù)細胞種類，選擇無血清或低血清培養(yǎng)基來降低細胞增殖的影響，或用Mitomycin（1μg/ml）處理1h，抑制細胞的分裂，消除增殖的影響。但同時也會影響細胞遷移的速度。
10.一般拍照時間為0，2，4，6，8，10，12，16，24小時等選取，不建議超過24h，過度增殖造成實驗假陽性結(jié)果。
11.手工劃痕可能難以保證寬度一致性，culture Insert是現(xiàn)在市面上也推出的一種可以提前占據(jù)劃痕區(qū)域的模具，將細胞接種于Dish中間的Insert培養(yǎng)，細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert產(chǎn)生筆直且無細胞損傷的劃痕。
12.分析結(jié)果中長度法，由于細胞遷移并不是齊頭并進的，可能組間差異大，建議用平均多條距離的值來代表。

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