鐵死亡預(yù)測物被揭示，或可成性標志為惡性腫瘤的新治療靶點

骨肉瘤（OS）是骨骼系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占所有骨瘤的56%。OS起源于惡性間充質(zhì)細胞產(chǎn)生的類骨或未成熟骨，因此通常影響兒童和青少年。由于其惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、易復(fù)發(fā)、耐藥等特點，其死亡率高，預(yù)后差。

越來越多的證據(jù)表明，誘導(dǎo)非凋亡細胞死亡是一種新型抗腫瘤策略，能用來克服現(xiàn)有的腫瘤耐藥問題。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細胞死亡形式，具有多種形態(tài)特征、誘導(dǎo)因子和調(diào)節(jié)機制。因此，靶向調(diào)控腫瘤細胞鐵死亡可能是治療腫瘤較有前景的方法。目前已證實在肝細胞癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌和腎癌等不同類型的癌癥中，鐵死亡在限制癌細胞生長、增強細胞殺傷和克服耐藥性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，不同腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性是高度異質(zhì)性的，因此需要進一步深入了解調(diào)控整個過程的分子機制。

最新研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡抑制蛋白1( Ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)  能夠減少脂質(zhì)過氧化物，從而抑制鐵死亡。值得關(guān)注的是，抑制 FSP1 可選擇性地使癌細胞對鐵死亡變得敏感，從而突出了其可作為潛在生物標志物和治療靶點。

2024年2月17日，來自意大利東皮埃蒙特大學(xué)的研究團隊在Cell Death Discovery雜志發(fā)表了題為FSP1 is a predictive biomarker of osteosarcoma cells susceptibility to ferroptotic cell death and a potential therapeutic target 的文章，在這項研究中，他們發(fā)現(xiàn)OS細胞的異質(zhì)性細胞反應(yīng)和對鐵死亡的敏感性與 FSP1 的基礎(chǔ)表達直接相關(guān)，抑制 FSP1 的表達或活性可以有效地使耐藥 OS 細胞對鐵死亡重新敏感。此外，他們還揭示了調(diào)節(jié) OS 細胞中 FSP1 基礎(chǔ)表達的分子機制，從而表明 FSP1 是一種新的有價值的預(yù)測性生物標志物，可以預(yù)測 OS 對鐵死亡的敏感性，并有可能成為一種新的治療靶點。

1. OS 對鐵死亡的敏感性具有異質(zhì)性

根據(jù)腫瘤類型、微環(huán)境和獲得性突變，癌細胞對鐵死亡具有異質(zhì)性的敏感性，使每個腫瘤成為一個奇特的實體，增加了確定正確治療方案的難度。因此，為了評估人骨肉瘤對鐵死亡的敏感性，他們評估了 3 個人骨肉瘤細胞系 U2OS、MG63 和 HOS 中這種非凋亡細胞死亡過程的誘導(dǎo)和執(zhí)行。

將 3 株細胞系經(jīng) 0.5µM RSL3 處理，8 小時后通過 qPCR 檢測已知鐵離子標記物 PTGS2 和 SLC7A11 的表達情況。結(jié)果表明，與未處理對照組相比，RSL3 處理細胞中 PTGS2 和 SLC7A11 均顯著上調(diào)，脂質(zhì) ROS 在 HOS 中大量積累，在 MG63 中略少，在 U2OS 中明顯降低。有趣的是，在三種細胞系中，鐵細胞死亡的執(zhí)行有顯著差異，具體表現(xiàn)為：在 RSL3 的作用下，HOS 細胞的活力顯著下降，為 17%，MG63 對處理也很敏感，細胞活力下降到 34%，而 U2OS 細胞對處理無反應(yīng)  (細胞活力為 93%)。總的來說，這些結(jié)果清楚地表明，U2OS 對鐵死亡最耐藥，而 HOS 對鐵死亡最敏感。

2. 骨肉瘤的 EMT 和鐵離子敏感性

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化  (Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT) 是骨肉瘤從原發(fā)部位脫離并獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性表型的重要機制。此外，一些證據(jù)表明，化療耐藥或接受 EMT 的癌細胞可能對鐵死亡表現(xiàn)出更大的脆弱性。

他們在三種骨肉瘤細胞系  (U2OS、MG63 和 HOS) 中檢測了 EMT 標記物的表達，包括轉(zhuǎn)錄因子 TWIST1 和 SNAIL、細胞粘附分子 N-Cadherin (N-Cad) 和 E-cadherin (E-Cad)、基質(zhì)金屬蛋白酶 9 (MMP9) 和中間絲蛋白 Vimentin (VIM) 的表達。除 E-Cad 外，EMT 標記物在鐵死亡敏感的 HOS 細胞株中表達明顯增強，上皮標記物 E-Cad 在最耐藥的 U2OS 中表達最高，而在 MG63 和 HOS 中表達程度較低。

他們還通過 Transwell 遷移實驗評估了細胞的侵襲能力。結(jié)果表明，HOS 細胞的侵襲性高于 MG63 和 U2OS，而 U2OS 的侵襲性較小?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)清楚地表明 EMT 與骨肉瘤細胞的鐵死亡之間存在相關(guān)性。

3. FSP1 在 OS 抵抗鐵死亡誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用

鐵死亡抑制蛋白 1 (FSP1)，也被稱為細胞凋亡誘導(dǎo)因子線粒體 2 (AIFM2)，是一種新近發(fā)現(xiàn)的鐵死亡抑制因子，它與 GPX4 共同工作，但獨立于 GPX4。因此，為了研究 FSP1 在 OS 細胞鐵死亡中的潛在作用，他們首先評估了其基礎(chǔ)表達水平。數(shù)據(jù)顯示，U2OS 細胞的 FSP1 mRNA 表達量最高，HOS 細胞的 FSP1 mRNA 表達量最小，MG63 細胞的 FSP1 mRNA 表達量居中。這些結(jié)果提出了一種假設(shè)，即 FSP1 的基礎(chǔ)表達可能被用作 OS 對鐵死亡執(zhí)行敏感性的潛在預(yù)測生物標志物。

數(shù)據(jù)顯示 RSL3 刺激的 FSP1 上調(diào)在最耐藥的 U2OS 中尤為明顯，而在 MG63 中不那么明顯，在最敏感的 HOS 中更溫和，這進一步證實了 FSP1 可能參與 OS 細胞對鐵死亡的耐藥性。

為了驗證我們的假設(shè)，他們使用特異性抑制劑 iFSP1(6µM) 抑制 FSP1 的活性，并將所有 OS 細胞株暴露在 0.5µM RSL3 環(huán)境下 24 小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有 OS 細胞株對鐵死亡的敏感性增強。重要的是，F(xiàn)SP1 抑制恢復(fù)了耐藥 U2OS 細胞的表型，使這些細胞對鐵死亡高度敏感。

此外，他們也在 3D OS 球體中評估了 OS 細胞對 RSL3 誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性。與 2D 細胞培養(yǎng)的結(jié)果一致，3D 的實驗結(jié)果也表明：HOS 細胞比 MG63 更敏感，并且 FSP1 抑制持續(xù)增加了兩種細胞類型對 RSL3 處理的敏感性。

4. NRF2 在 OS 細胞中不調(diào)控 FSP1 的表達

為了檢測 NRF2 是否參與了 FSP1 的基礎(chǔ)表達調(diào)控，他們在骨肉瘤細胞系中評估了該轉(zhuǎn)錄因子的蛋白和 mRNA 水平。研究發(fā)現(xiàn)，在 U2OS 中 NRF2 的表達與 HOS 中非常相似，而在 MG63 中 NRF2 的表達在蛋白水平和 mRNA 水平上都略高。在評估 NRF2 負調(diào)控因子 KEAP1 的表達時也得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明了 NRF2 可能不參與 FSP1 基礎(chǔ)表達的調(diào)節(jié)。

不過，NRF2 在鐵死亡過程中的作用已被描述，該因子參與鐵死亡的氧化應(yīng)激所引起的一般抗氧化靶基因的調(diào)控，以及鐵誘導(dǎo)特異性因子的調(diào)控。因此，為了驗證 NRF2 信號通路的完整性及其在鐵離子刺激下的迅速激活，他們評估了氧化應(yīng)激相關(guān) HO-1 和 NQO1 以及鐵離子相關(guān) GPX4 和 SLC7A11 的表達。整體數(shù)據(jù)表明，NRF2 在鐵死亡早期被激活，但不參與 FSP1 的基礎(chǔ)表達。

5. p53 在 OS 細胞中參與調(diào)節(jié) FSP1 的基礎(chǔ)表達

接下來，他們在 p53 缺失的 MG63 細胞中短暫過表達野生型 p53，并評估 FSP1 的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG63 細胞中野生型 p53 的 FSP1 基因表達量呈劑量依賴性增加。后續(xù)的實驗結(jié)果也表明，抑制 p53 的表達可以降低 FSP1 的基礎(chǔ)表達，說明 p53 在骨肉瘤細胞中參與調(diào)控 FSP1 的基礎(chǔ)表達。

結(jié)語

綜上所述，他們基于最近描述的一種新的程序性細胞死亡形式，即鐵死亡，探索了一種潛在的殺死骨肉瘤細胞的策略，它的特征是鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物（非凋亡細胞死亡的執(zhí)行者），為傳統(tǒng)療法抵抗的癌癥提供了新的治療機會。